[发明专利]3’硫代-2’脱氧核糖-3’硝基吡咯亚磷酰胺单体及其合成方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及3’硫代-2’脱氧核糖-3’硝基吡咯亚磷酰胺单体及其合成方法和应用，化学基团修饰的硫代-2’脱氧核糖-3’硝基吡咯亚磷酰胺分子可以用于固相核酸合成的单体原料，其固相合成寡核苷酸产物除了具有传统寡核苷酸的生物学性能外，还具有被化学切割的性能，可以用于核酸、蛋白质等生物大分子的检测。

技术背景

在分子生物学研究中，DNA的序列分析是进一步研究和改造目的基因的基础，对生命科学至关重要。随着人类基因组计划和各种模式生物基因组计划的开展和完成，使人类步入了后基因时代，分子生物学相关学科得到了迅猛的发展。从基因水平上认识生命的差异，疾病发生、发展的规律，以及药物与生命体的相互作用将成为可能。在基础研究方面，研究疾病基因的遗传规律，克隆致病基因；在应用方面，直接寻找疾病的易感基因突变位点，可以获得有关与该疾病相关基因型的信息。通过DNA序列信息的分析可以为理解生命的起源、疾病发生、以及个体化医疗等提供有用的相关核酸序列信息。

对DNA序列的分析包括位点(如单碱基多态性、甲基化、突变等)，片段序列(如片段重复、缺失等)、全基因组序列分析和DNA蛋白质相互作用。针对这些不同的分析对象，目前已有各种不同的方法相应方法被广泛应用，而这些方法中有许多涉及到核酸需要被切割的手段。如在桥式PCR扩增中需要对一条链进行切除，以获得单链DNA模板用来进行核酸分析；在DNA与蛋白质的序列特异性识别和相互作用检测中，需要借助核酸片段是否能够切割来判断双链DNA是否与蛋白质发生了结合，从而达到非标记检测蛋白的目的；在基于标记荧光的高通量测序过程中，需要将每次测序中的标识荧光分子切除，以便顺利进行下一个位置碱基的序列测定等。要实现这些不同的切割的手段，目前需要针对核酸片段进行特殊的修饰，或者采用特定的酶切或者化学切割方法，这些方法中要么合成难度大，或者难于找到合适的切割试剂而给研究工作带来困难。

本发明制备的是3’硫代-2’脱氧核糖-3’硝基吡咯亚磷酰胺分子可以作为固相核酸合成的基本原料，通过广泛使用的核酸合成仪在合成的序列片段中很方便的引入硫代-2’脱氧核糖-3’硝基吡咯来实现核酸序列分析中切割方法的实现。由于引入的硫代-2’脱氧核糖-3’硝基吡咯(简写成“M”)具有通用碱基的性能，能很好的和4种碱基配对，在任何位置均能满足与四个碱基的杂交效果，且比其它通用碱基具有更平均的杂交温度(Bergstrom，D.E.，et al. Synthesis，structure，and deoxyribonucleic acid sequencing with a universal nucleoside：1-(2’-Deoxy-β-D-rinbofuranosyl)-3-nitropyrrole.J.Am.Chem.SOC.1995，117，1201-1209)，能够在核酸分析中得到广泛的应用。

发明内容

解决的技术问题：本发明的目的是提供3’硫代-2’脱氧核糖-3’硝基吡咯亚磷酰胺单体及其合成方法和应用，为新的核酸序列分析技术所能利用的试剂，为新核酸序列分析技术的低成本、高速度和高通量奠定基础。

技术方案：3’硫代-2’脱氧核糖-3’硝基吡咯亚磷酰胺单体，结构为：

该分子由硝基吡咯基团、3’硫代脱氧核糖基团和亚磷酸基团构成，亚磷酸基团中连接R₁和R₂基团构成亚磷酰胺基团，脱氧核糖基团的5’羟基位置上连接着基团R₃，R₁选自于：R₂选自于：

-OCH₃、-OCH₂CH₃、-OCH₂CH₂CN、-OC(CH₃)₂CH₂CN、-OC(CH₃)₂CCl₃、R₃选自于：

3’硫代-2’脱氧核糖-3’硝基吡咯亚磷酰胺单体的合成方法，具有如下结构：

具体合成步骤为：