[发明专利]一种缩短DNA模板的DNA测序方法及其应用

权利要求书

1.一种缩短DNA模板的DNA测序方法，其特征在于（1）引入一段包含IIS限制性内切酶识别位点的目标寡核苷酸序列作为序列测定的起点，采用合成或者连接测序方法将固定DNA模板中的一小段序列测定；（2）停止该测序引物的测序，并加入四种dNTPs单体延伸测序引物链，使DNA模板成为双链；（3）缩短DNA模板：用限制性内切酶处理预先设定包含酶识别序列的连接子，将已经测定的DNA模板中的一小段序列断裂；（4）将测序引物、且包含酶识别序列的双链寡核苷酸片段，连接到上述切割后的缩短DNA模板上；（5）变性，除去未固定的DNA链，重新获得DNA模板；（6）杂交测序引物，继续对固定DNA模板中的一小段序列进行测定；（7）重复步骤（2）到（6），直到未测定DNA模板序列测定完成；所述DNA模板中的一小段序列测定是根据酶切位点距离酶识别位点的核苷酸个数确定的，已经被测序的序列片段是酶识别位点切割DNA模板的位置；DNA模板的每次制备过程中均需引入酶识别位点，酶切位点距离酶识别位点的核苷酸个数是确定的。

2.根据权利要求1所述的缩短DNA模板的DNA测序方法，其特征在于酶识别序列是指限制性内切酶识别位点，其断裂位点为距离识别位点的2-30个碱基。

3.根据权利要求1所述的缩短DNA模板的DNA测序方法，其特征在于酶识别序列是指限制性内切酶识别位点，，最佳断裂位点为距离识别位点8-25个碱基。

4.缩短DNA模板的DNA测序方法在测定人基因组中的应用，其特征在于步骤为：

（1）将人基因组用Fok I酶在37℃处理2小时后，超声破碎成大小为50-1000碱基的片段，并在连接酶的作用下将这些片段化核酸序列用一对通用连接子进行连接，其中的一个通用连接子的寡核酸序列与扩增引物的序列完全互补，而另一个连接子的寡核酸序列包含了Mly I酶能识别序列，且该特定区域位于模板测序最开始位置；

（2）将这些连接臂连接的片段化核酸序列与固定连接子互补序列到微珠进行乳液并行PCR反应，扩增片段化的人全基因组，并将这些微珠固定到平板基片上，并通过变性得到人全基因组单链DNA测序模板；

（3）将3’末端含有Mly I酶能识别序列的测序引物与固定的DNA模板杂交；

（4）在DNA模板指导下，采用商业化的SOLiD连接测序试剂及其测序方法，测定所有DNA模板的前9个碱基；

（5）当第9个碱基测定完成后，清洗反应池，加入四种dNTPs单体，在DNA聚合酶的作用下，37℃反应0.5小时，延伸测序引物链，并与DNA模板成为双链，并清洗反应池；

（6）将Mly I酶及其缓冲液加于上述反应池中，在37℃反应2小时，切割双链DNA其断裂位点为识别序列3′末端下游9或者5′末端下游11个碱基处，并用T4激酶将5末端磷酸化；

（7）将新测序引物片段，且包含下列酶Mly I识别序列，所述上游引物应补齐2碱基缺口： 

对应测序引物序列：5'...GGCGGA(N)₂； 对应测序引物序列互补序列，p表示磷酸基团：3' ... CCGCCT'p ；

以双链寡核苷酸片段，与上述切割、缩短的双链DNA模板在T4连接酶作用下反应0.5小时；

（8）用0.1M NaOH处理上述连接后的双链DNA模板10分钟，变性获得新单链DNA模板；

（9）重复步骤（4），得到新模板上1-9个碱基的序列信息；

（10）重复步骤（4）到（9），进行循环测序，每重复一次增加9个碱基位置的序列测定长度；

（11）将所有位置上DNA模板的碱基序列片段完成组装，得到人全基因组DNA序列。

5.缩短DNA模板的DNA测序方法在测定大肠杆菌基因组中的应用，其特征在于步骤为：

（1）将大肠杆菌基因组用Mme I酶在37℃处理2小时后，超声破碎成大小为50-1000碱基的片段，并在连接酶的作用下将这些片段化核酸序列用一对通用连接子进行连接，其中的一个通用连接子的寡核酸序列与扩增引物的序列完全互补，而另一个连接子的寡核酸序列包含了Mme I酶能识别序列，且该特定区域位于模板测序最开始位置；

（2）将这些连接臂连接的片段化核酸序列与固定连接子互补序列到微珠进行乳液并行PCR反应，扩增片段化的大肠杆菌基因组，并将这些微珠固定到平板基片上，并通过变性得到大肠杆菌基因组单链DNA测序模板；

（3）将3’末端含有Mme I酶能识别序列的测序引物与固定的DNA模板杂交；

（4）在DNA模板指导下，采用商业化的Solexa 延伸测序试剂及其测序方法，测定所有DNA模板的前18个碱基；

（5）当第18个碱基测定完成后，清洗反应池，加入四种dNTPs单体，在DNA聚合酶的作用下，37℃反应0.5小时，延伸测序引物链，并与DNA模板成为双链，并清洗反应池；

（6）将Mme I酶及其缓冲液加于上述反应池中，在37℃反应2小时，切割双链DNA其断裂位点为识别序列3′末端下游18或者5′末端下游20个碱基处，并用T4激酶将5末端磷酸化；

（7）将新测序引物片段，且包含下列酶Mly I识别序列，上游引物需要补齐2碱基缺口： 

对应测序引物序列：5' ... TCCRAC (N)₂ ；

对应测序引物序列互补序列，p表示磷酸基团：3' ... AGGYTGp；

以双链寡核苷酸片段，与上述切割、缩短的双链DNA模板在T4连接酶作用下反应0.5小时；

（8）用0.1M NaOH处理上述连接后的双链DNA模板10分钟，变性获得新单链DNA模板；

（9）重复步骤（4），得到新模板上1-18个碱基的序列信息；

（10）将所有位置上DNA模板的36个碱基序列片段完成组装，得到大肠杆菌基因组全基因组DNA序列。