[发明专利]一种缩短DNA模板的DNA测序方法及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术中基因测序技术领域，具体涉及一种缩短DNA模板的DNA测序方法及其应用，尤其适合高通量DNA测序。

技术背景

人类基因组计划和各种模式生物基因组计划的开展和完成，使人类步入了后基因时代，对当代的生物学研究和医学研究产生了巨大的影响，分子生物学相关学科得到了迅猛的发展。从基因水平上认识生命的差异，疾病发生、发展的规律，以及药物与生命体的相互作用将成为可能。就基因序列分析而言，后基因时代的重点已由全基因组序列测定转移到了对基因组中个体遗传差异及物种间遗传差异的比较。在基础研究方面，DNA的序列分析是进一步研究和改造目的基因的基础，研究疾病基因的遗传规律，克隆致病基因；在应用方面，直接寻找疾病的易感基因突变位点，通过对某一特定疾病的基因组样本中突变基因型进行大规模鉴定和检测，可以获得有关与该疾病相关基因型的信息。目前，最为广泛应用的测序技术是Sanger等(1977)发明的双脱氧链末端终止法，传统的Sanger DNA测序法仍处于无可替代的地位，但这一方法存在通量低和价格高的问题。第一个人类基因组序列测定的费用大约为10亿美元，目前这一费用已经降低到大约2千万美元，因此，功能基因组的研究进展仍然受限于DNA测序技术。为此，美国Venter基金会在2003年提出了1000美金人类全基因组测序的研究目标。2004年初，美国国立卫生院投入7千多万美元支持DNA测序新技术的研究计划，其目标是发展10万美金的测序技术，并最终减低为1千美金。目前，全基因组DNA测序技术已经成为国际上一个竞争十分激烈的研究领域。美国的454Life Sciences公司基于乳液PCR产物的高通量并行焦测序技术；Illumina(Solexa)公司的桥式扩增-DNA芯片延伸测序技术；以及AppliedBiosestems(SOLiD)公司基于乳液PCR产物的杂交-酶连接-酶切割高通量测序技术都有成熟的商品化仪器上市。此外，一些基于单分子测序的高通量测序仪也开始面世。

然而，所有这些高通量测序仪仪器不管是采用标记染料核苷酸的合成法，还是采用标记探针的连接法，其特点均是测序引物的不断延长。然而不管合成、还是连接测序方法，效率总不可能达到100％，每步测序反应均要消耗掉一定的“正确”测序引物，而产生一些“错误”的测序引物，因此，随着合成(或者连接)次数的不断增加，这种累积的错误便越来越多，而测序的准确性是由正确合成(或者连接)的标记物信号给出的，于是，其测序准确性便越来越差。

发明内容

解决的技术问题：本发明的目的是提供一种缩短DNA模板的DNA测序方法及其应用，该方法采用循环“测序引物”的高通量测序技术，即将已经测定的DNA模板中的一段序列切割掉(缩短DNA模板)，并重新连接测序引物片段后，继续对未测定DNA模板进行序列测定，为全基因组DNAD序列分析提供一种新方法，建立准确，增加测序长度的，便宜基因组序列测定技术。

技术方案：一种缩短DNA模板的DNA测序方法，(1)引入一段包含IIS限制性内切酶识别位点的目标寡核苷酸序列作为序列测定的起点，采用合成或者连接测序方法将固定DNA模板中的一小段序列测定；(2)停止该测序引物的测序，并加入四种dNTPs(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)单体延伸测序引物链，使DNA模板成为双链；(3)缩短DNA模板：用限制性内切酶处理预先设定包含酶识别序列的连接子，将已经测定的DNA模板中的一小段序列断裂；(4)将测序引物、且包含酶识别序列的双链寡核苷酸片段，连接到上述切割后的缩短DNA模板上；(5)变性，除去未固定的DNA链，重新获得DNA模板；(6)杂交测序引物，继续对固定DNA模板中的一小段序列进行测定；(7)重复步骤(2)到(6)，直到未测定DNA模板序列测定完成；所述DNA模板中的一小段序列测定是根据酶切位点距离酶识别位点的核苷酸个数确定的，已经被测序的序列片段是酶识别位点切割DNA模板的位置；DNA模板的每次制备过程中均需引入酶识别位点，酶切位点距离酶识别位点的核苷酸个数是确定的。

所述酶识别序列是指限制性内切酶识别位点，其断裂位点为距离识别位点的2-30个碱基。

所述酶识别序列是指限制性内切酶识别位点，，最佳断裂位点为距离识别位点8-25个碱基。

缩短DNA模板的DNA测序方法在测定人基因组中的应用，步骤为：