[发明专利]一种沙门氏菌荧光定量PCR检测试剂盒及其检测方法

权利要求书

1.一种沙门氏菌的荧光定量PCR检测试剂盒，包括沙门氏菌PCR反应液、Taq酶、阳性对照及阴性对照，所述沙门氏菌PCR反应液含有以下成分： PCR缓冲液，dNTP，其特征在于，所述沙门氏菌PCR反应液还含有沙门氏菌特异性上游引物、下游引物和探针，所述引物及探针序列如下：

上游引物：5’- TGCGCCTGCCGTTATCAC -3’；

下游引物：5’- AATTGAGCTGTTGGTTCAGTAACTC -3’；

探针序列：5’- CCAACGCCGCAGATATTTGATCGCC-3’。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR缓冲液中含有MgCl₂  ，所述MgCl₂浓度为1.5 mM；所述dNTP浓度为0.1-0.5 mM；上、下游引物浓度为0.1-1.0μM，探针浓度为0.1-0.5μM；Taq酶浓度为0.5-5U/反应。

3.一种检测沙门氏菌的荧光定量PCR方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）针对沙门氏菌的fimY基因设计合成引物和探针，以FAM为报告基团，以BHQ-1为淬灭基团，序列如下：

上游引物：5’- TGCGCCTGCCGTTATCAC -3’；

下游引物：5’- AATTGAGCTGTTGGTTCAGTAACTC -3’；

荧光探针：5’- CCAACGCCGCAGATATTTGATCGCC-3’；

（2）制备阳性标准品：将上述引物的PCR产物克隆到载体上构建成质粒，然后提取阳性克隆质粒作为阳性标准品；

（3）制备阳性标准品梯度：取上述阳性克隆质粒5μL，按10倍梯度稀释，依次稀释4-7个梯度即为阳性标准品梯度；

（4）提取待测样品基因组DNA；

（5）以步骤（4）的基因组DNA为模板，步骤（1）的引物和探针在优化的荧光定量PCR反应体系和反应条件下检测样品中的沙门氏菌；

（6）根据荧光定量PCR的扩增曲线是否有指数扩增判断结果，如果有指数扩增，表明样本含有沙门氏菌；如果没有，则样本中不含沙门氏菌。

4.如权利要求3所述的检测方法，其特征在于所述反应体系包括：PCR缓冲液，dNTP，上游引物、下游引物，荧光探针，Taq酶，待测DNA模板。

5.如权利要求3所述的检测方法，其特征在于所述的反应条件如下： 94℃预变性2min；94℃变性5sec，55℃退火35sec，40个循环。