[发明专利]一种沙门氏菌荧光定量PCR检测试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明属于微生物检测领域，具体涉及一种利用沙门氏菌的高度保守序列设计特异性引物和探针，运用荧光定量PCR技术开发的检测沙门氏菌的试剂盒及其检测方法。 

背景技术

沙门氏菌属是一群形态和培养特性都类似的肠杆菌科的一个大属，其菌型繁多，分布广泛，是常见的重要的人畜共患病病原菌之一，也是引起人发生食物中毒最常见的病原菌。据统计，在世界各国的细菌性食物中毒中，沙门氏菌引起的食物中毒常列榜首。在我国，以沙门氏菌引起的食物中毒也排在细菌性食物中毒的首位，为了查找引起食物中毒的病原菌，通常采集患者的排泄物、呕吐物、粪便、剩余食物、用具等进行检测，其中以粪便的检测最为常见和普遍，粪便中沙门氏菌的检测对患者的诊断及治疗具有重要的指导意义。 

目前，世界各国对食源性沙门氏菌的检测方法及限量标准均制定出了非常严格的规定，使受污染的食品能够得到及时处理，以保障食品质量及食品安全。然而，包括我国在内的许多国家对沙门氏菌的临床检测仍然采用传统的培养方法，这种方法程序繁琐，耗费大量的时间，报告检验结果大约需要4-7天，已经远远不能满足现代快速检测诊断的需要。因此，建立一种快速、准确的临床沙门氏菌检测方法显得尤为重要。 

  

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种沙门氏菌检测试剂盒及检测方法。 

本发明通过以下技术方案实现上述目的： 

一种检测沙门氏菌的试剂盒，其组成包括：沙门氏菌PCR反应液、Taq酶、阳性对照及阴性对照。

1、所述的沙门氏菌PCR反应液包括：PCR缓冲液（含MgCl₂），dNTP以及沙门氏菌特异性上游引物、下游引物和探针，其中MgCl₂  浓度1.5 mM；dNTP浓度为0.1-0.5 mM；上、下游引物浓度为0.1-1.0μM，探针浓度为0.1-0.5μM。 

2、根据沙门氏菌fimY基因序列（GenBank登录号为M90677）设计并合成特异性引物和荧光探针，其序列如下： 

上游引物：5’- TGCGCCTGCCGTTATCAC -3’；

下游引物：5’- AATTGAGCTGTTGGTTCAGTAACTC -3’；

荧光探针：5’- CCAACGCCGCAGATATTTGATCGCC-3’。

3、制备阳性标准品即阳性对照：上述引物的PCR扩增的阳性产物经过2%低熔点琼脂糖凝胶电泳，在长波紫外下，切下目的条带回收纯化，将产物连接到载体上构建成质粒。提取阳性克隆质粒，稀释到适当的浓度即可作为阳性标准品。 

4、为了达到定量的效果，利用阳性克隆质粒稀释制备阳性标准品梯度：取上述阳性质粒5μL，按10倍梯度稀释，依次稀释4-7个梯度即为阳性标准品梯度。以梯度阳性标准品及样本DNA在相同条件下进行荧光定量PCR反应，以梯度阳性标准品的浓度对数值为纵坐标，实验结果Ct值为横坐标绘制标准曲线，根据样本测试得到的Ct值，可计算获得样本中的沙门氏菌的浓度。 

本发明的另一目的在于提供一种检测沙门氏菌的方法，其步骤如下： 

1、提取待测样品基因组DNA。

2、以上述基因组DNA为模板，设定阳性标准品对照和双蒸水阴性对照，与沙门氏菌PCR反应液及Taq酶混合配制PCR反应体系，在优化的反应条件下进行荧光定量PCR反应。 

3、选择荧光检测模式检测FAM荧光，以6-15个循环的荧光信号标准差的10倍作为阈值，以正常阴性对照荧光值的最高点作为基线，由电脑自动分析并计算结果。 

所述步骤2中PCR反应体系终浓度组成如下：1×PCR 缓冲液，0.1-0.5mM dNTP，0.1-1.0μM上、下游引物，0.1-0.5μM荧光探针，0.5-5U/反应的Taq酶，10-1000ng/μL基因组DNA模板； 

所述步骤2中的反应条件为：94℃预变性2min；94℃变性5sec，55℃退火35sec，40个循环。

荧光定量PCR检测技术融合传统PCR技术、荧光标记技术、激光技术、数码显像技术为一体，具有很高的检测灵敏度，同时，扩增的目标序列由特异性引物和荧光探针双重控制，具有更好的特异性，使检测假阳性大大降低。