[发明专利]一种同步检测猪圆环病毒2型、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的方法

权利要求书

1.一种同步检测猪圆环病毒2型、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的方法，其特征在于：利用PRRSV、PCV2和CSFV 3种病毒核酸设计3对特异性探针，利用PCR制备探针标记的报告基因，然后再通过报告基因的环化和反向PCR扩增，实现对3种病毒的环介导间接PCR检测。

2.根据权利要求1所述的同步检测猪圆环病毒2型、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的方法，其特征在于：具体包括以下步骤：

(1)探针和引物的设计

根据GenBank数据库中猪圆环病毒2型(PCV2)、猪瘟病毒(CSFV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的高度保守性核苷酸序列设计3对特异性探针；选择大豆Lectin基因作为报告基因，并以此基因片段的核苷酸序列为模板设计1对正向PCR扩增引物和1对反向PCR扩增引物；将3对特异性探针分别置于正向PCR扩增引物的上下游引物的末端，即构成3对针对不同病毒的标记用引物，将标记用引物和反向PCR扩增引物进行合成，用于环介导间接PCR扩增；

(2)病毒核酸的制备；

(3)报告基因的制备；

用3对标记用引物分别扩增大豆Lectin基因，经PCR产物回收后获得3种标记的报告基因，每条报告基因两端带有2条探针，此3种报告基因分别针对不同病毒；

(4)单病毒环介导间接PCR检测；

将不同的报告基因与待检核酸混合，报告基因携带的探针与目的基因进行杂交，形成杂合分子，之后在嗜热DNA聚合酶和嗜热DNA连接酶作用下，经缺口补平及连接，实现报告基因的环化，再采用反向PCR扩增报告基因，间接检测3种病毒；

(5)多病毒环介导间接PCR检测；

将3种报告基因与待检核酸混合，经探针杂交、缺口补平及连接，实现报告基因的环化，再采用反向PCR扩增报告基因，间接检测3种病毒。

3.根据权利要求1所述的同步检测猪圆环病毒2型、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的方法，其特征在于：所述步骤(1)中用于检测PCV病毒的标记引物序列为：

上游引物P1TCAAGAAGCCTCATCAC

下游引物P2TTTCACCAGGGTTTAGTT

其中斜体部分为探针序列；

所述步骤(1)用于检测PRRSV病毒的标记引物序列为：

上游引物P3TCAAGAAGCCTCATCACA

下游引物P4TTTCACCAGGGTTTAGTT

其中斜体部分为探针序列；

所述步骤(1)用于检测PRRSV病毒的标记引物序列为：

上游引物P5TCAAGAAGCCTCATCACA

下游引物P6TTTCACCAGGGTTTAGTT

其中斜体部分为探针序列；

所述步骤(1)进行反向PCR扩增的引物序列为：

上游引物P7ACGTGCTAGTGATGGCTAAG

下游引物P8TGTTGAGTCCTCTAGGTTGT。

4.根据权利要求1所述的同步检测猪圆环病毒2型、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的方法，其特征在于：所述步骤(1)检测3种病毒的标记引物序列在合成时，引物的5’末端均进行磷酸化修饰。

5.根据权利要求1所述的同步检测猪圆环病毒2型、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的方法，其特征在于：所述步骤(1)检测3种病毒的报告基因为大豆Lectin基因。

6.根据权利要求1所述的同步检测猪圆环病毒2型、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的方法，其特征在于：所述步骤(2)用氯仿+蛋白酶K法制备核酸DNA，采用Trizol试剂法制备核酸RNA。

7.根据权利要求1所述的同步检测猪圆环病毒2型、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的方法，其特征在于：所述步骤(3)备的针对PCV病毒的报告基因序列包含列表中的SEQIDNO.1。

8.根据权利要求1所述的同步检测猪圆环病毒2型、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的方法，其特征在于：所述步骤(3)备的针对PRRSV病毒的报告基因序列包含列表中的SEQIDNO.2。

9.根据权利要求1所述的同步检测猪圆环病毒2型、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的方法，其特征在于：所述步骤(3)中制备的针对CSFV病毒的报告基因序列包含列表中的SEQIDNO.3。

10.根据权利要求1所述的同步检测猪圆环病毒2型、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的方法，其特征在于：所述步骤(4)、(5)中环介导间接PCR检测主要包括2步反应：

第一步反应：报告基因的环化，通过探针与目的基因的杂交形成杂合分子，再经缺口补平及连接实现报告基因的环化，将目的基因的检测置换为对报告基因的检测；

第二步反应：反向PCR扩增，以环化的报告基因为模板，利用反向引物扩增报告基因，实现对目的基因的间接检测；所述步骤(4)、(5)中环介导间接PCR检测为反应体系为30μl，其中反向PCR扩增引物P7、P8各10pmol，dNTPs 0.3mM，10×Taq DNA Ligase Reaction Buffer 3μl，10×Ex Taq Buffer3μl，Taq DNA Ligase 0.3μl，Ex Taq 0.20μl，探针标记的报告基因和待检样本的核酸溶液各2μl；反应分三步进行，首先，进行95℃变性5min；之后按95℃50sec，60℃8min进行5个循环；最后按95℃30sec，52℃30sec，72℃30sec进行25个循环。