[发明专利]一种同步检测猪圆环病毒2型、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种环介导间接PCR检测猪圆环病毒2型(PCV2)、猪瘟病毒(CSFV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的方法，属于生物医药体外分子诊断技术。

技术背景

我国是养猪大国，养殖规模化、集约化程度不断提高，以病毒性传染病为首的猪病是目前影响养猪效益的主要因素之一，给养猪业造成了极大危害，尤以高致病性PRRSV引起的猪高热病为主。在引起猪高热症状的众多病毒因子中PRRSV扮演重要角色，是主要病原，其次为PCV2，再次为CSFV等。近年来，PRRSV在我国猪群中感染已极为普遍，并常因感染猪的免疫抑制，导致其它病原体的混合感染；PCV2感染无明显的临床症状，但可破坏免疫系统，造成免疫抑制，易继发并发其它病原体感染，尤其是和PRRSV的混合感染，使患病猪的致死率显著上升；由于PRRSV或PCV2感染猪的免疫抑制，促使了猪瘟的进一步流行，猪瘟的发病率和死亡率都有所回升。随着PRRSV、PCV2和CSFV等病毒因子在大范围内长期流行，病毒变异，毒力增强，一种和两种以上病原的混合感染，导致猪高热疾病仍将呈高发态势，如何防控仍将是未来很长时间内我国养猪业必须面临的实际问题。这3种病毒是引起猪“高热病”的主要病原，目前针对这3种病毒的实验室检测多采用剖检观察病理组织变化，再综合临床症状进行初步判断，对于多病毒混合感染的猪“高热病”，则很难通过剖检鉴别不同病原，而血清学检测如中和试验、ELISA和胶体金试纸等检测技术，普遍存在灵敏度和特异性低，不利于流行病监测和疾病管理。PCR技术是一种高度特异性和敏感性的分子诊断技术，广泛应用于上述3种病原的检测。常规PCR是利用1对特异性引物检测1种病原，对于多病原的混合感染需要多次PCR检测，检测时间长、成本高；在常规PCR基础上发展起来的多重PCR是在1支PCR管中利用多对特异性引物进行PCR扩增，可同时检测多种病原感染，在临床上对混合感染的鉴别诊断具有独特的应用价值。然而，多重PCR除具有易污染，假阳性和假阴性较高等常规PCR的缺点外，由于多重PCR扩增一般涉及2对或2对以上的引物，引物之间的交叉反应常常导致多重PCR检测灵敏度和特异性出现不同程度的下降，限制了多重PCR的应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种同步检测猪圆环病毒2型、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的方法，以实现对3种病毒的环介导间接PCR检测。

为了实现上述目的，本发明的技术方案采用了一种同步检测猪圆环病毒2型、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的方法，利用PRRSV、PCV2和CSFV3种病毒核酸设计3对特异性探针，利用PCR制备探针标记的报告基因，然后再通过报告基因的环化和反向PCR扩增，实现对3种病毒的环介导间接PCR检测。

具体包括以下步骤：

(1)探针和引物的设计

根据GenBank数据库中猪圆环病毒2型(PCV2)、猪瘟病毒(CSFV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的高度保守性核苷酸序列设计3对特异性探针；选择大豆Lectin基因作为报告基因，并以此基因片段的核苷酸序列为模板设计1对正向PCR扩增引物和1对反向PCR扩增引物；将3对特异性探针分别置于正向PCR扩增引物的上下游引物的末端，即构成3对针对不同病毒的标记用引物，将标记用引物和反向PCR扩增引物进行合成，用于环介导间接PCR扩增；

(2)病毒核酸的制备；

(3)报告基因的制备；

用3对标记用引物分别扩增大豆Lectin基因，经PCR产物回收后获得3种标记的报告基因，每条报告基因两端带有2条探针，此3种报告基因分别针对不同病毒；

(4)单病毒环介导间接PCR检测；

将不同的报告基因与待检核酸混合，报告基因携带的探针与目的基因进行杂交，形成杂合分子，之后在嗜热DNA聚合酶和嗜热DNA连接酶作用下，经缺口补平及连接，实现报告基因的环化，再采用反向PCR扩增报告基因，间接检测3种病毒；

(5)多病毒环介导间接PCR检测；

将3种报告基因与待检核酸混合，经探针杂交、缺口补平及连接，实现报告基因的环化，再采用反向PCR扩增报告基因，间接检测3种病毒。

所述步骤(1)中用于检测PCV病毒的标记引物序列为：

上游引物P1TCAAGAAGCCTCATCAC

下游引物P2CTGTCATTTCACCAGGGTTTAGTT

其中斜体部分为探针序列；

所述步骤(1)用于检测PRRSV病毒的标记引物序列为：