[发明专利]外显子保守序列扩增多态性分子标记及其分析方法

权利要求书

1.外显子保守序列扩增多态性分子标记及其分析方法，其特征在于: 利用己知物种的公用数据库中的mRNA序列信息，找出基因外显子的5碱基寡聚核苷酸保守序列，以这个保守序列为核心，在其3’端连接6碱基随机序列构成11碱基序列，与5’端的固定序列共同组成20bp的引物。

2.通过mRNA数据库初步筛选出11碱基序列出现频率较高的引物，再用PCR对其进行重复性筛选，得到作为基于FCR的外显子保守序列扩增多态性标记，主要技术步骤是:

（1）序列下载及分析: 从NCBI网站下载已公布物种的mRNA序列，构建mRNA数据库，用编程软件Delphi 7.0（Borland Software Corporation, USA）进行编程，将四种碱基（A、T、C、G）组合产生1024种5碱基寡聚核苷酸序列，通过编制的程序把这些寡聚核苷酸序列与mRNA数据库的每一条记录逐一进行比较，得出在数据库的mRNA序列中出现频率较高的5碱基寡聚核苷酸序列；

（2）引物设计: 引物由三个部分组成，即核心区域、3’端随机序列及5’端序列，引物的核心区域为步骤（1）搜索得到的出现频率较高的5碱基寡聚核苷酸序列，在核心区域外的3’端为6碱基随机序列，与核心区域构成11碱基序列，5’端固定为GTGTGCCAG，所有引物长度为20bp；

（3）引物初步筛选: 通过编制的程序，把11碱基序列与本物种或与其近缘物种的mRNA数据库的每一条记录逐一进行比较，筛选出11碱基序列在数据库的核苷酸序列中出现频率较高的引物；

（4）引物的重复性筛选: 用步骤3筛选的出现频率较高的引物进行PCR筛选出重复性好的引物。

3.根据权利要求1所述的外显子保守序列扩增多态性分子标记及其分析方法，其特征在于: 所述出现频率是指含5碱基寡聚核苷酸序列的mRNA序列数占数据库中mRNA序列总数的比例。

4.根据权利要求1所述的外显子保守序列扩增多态性分子标记及其分析方法，其特征在于: 所述本物种是指要进行分子标记的物种。

5.根据权利要求1所述的外显子保守序列扩增多态性分子标记及其分析方法，其特征在于: 所述近缘物种是指与要进行分子标记的物种在进化上较近的物种。

6.根据权利要求1所述的外显子保守序列扩增多态性分子标记及其分析方法，其特征在于: 所述PCR反应程序为: 95℃初始变性5min，接下来进行35个循环，每个循环进行为: 95℃ 30sec、50-55℃ 30sec和72℃ 1.5-2min，最后一个循环延伸为72℃ 10min，PCR产物用8%的聚丙烯酰胺胶电泳分离，用硝酸银染色观察。

7.权利要求1所述的外显子保守序列扩增多态性分子标记及其分析方法在农作物品种资源遗传多样性和识别方面的应用。