[发明专利]外显子保守序列扩增多态性分子标记及其分析方法

说明书

技术领域

本发明属于基因组学、生物信息学领域，涉及外显子保守序列扩增多态性分子标记(Conserved sequence of exon amplified polymorphism，CSEAP)及其分析方法。

背景技术

分子标记是以生物大分子(主要是遗传物质DNA)的多态性为基础的一种遗传标记，具有数量多、多态性高、不受季节、环境影响、检测手段简单迅速等多种优点。分子标记已经成为生命科学的前沿领域，广泛应用于生物遗传多样性分析、遗连锁图谱构建、种质资源鉴定、基因定位、亲缘关系分析、性别鉴定、基因组作图、基因克隆、文库构建和分子标记辅助选择育种等多个方面。

自1980年首次提出分子标记的概念以来，分子标记的研究不断有相关的文献报道，特别是上世纪90年代以来，发展十分迅速。目前，可用于分子标记的方法超过十种，在植物的分子遗传研究中应用比较多的有：DNA限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)、随机扩增多态性DNA(Random amplified polymorphism，RAPD)、简单重复序列(Simple Sequence Repeat，SSR)、扩增片段长度多态性(Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP)和单核苷酸多态性(Sigle nucleotide polymorphisms，SNP)等，分子标记体系类型多样，应用广泛，但各自的技术复杂性、可靠性与提供的遗传信息丰富度不同。

1980年Botstein等提出了RFLP分子标记技术(Botstein D，White R L，Skolnick M，Davis R W.Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms.American Journal of Human Genetics，1980，32：314-331)，从此开创了利用DNA多态性进行分子标记的新阶段。该方法的基本原理为：将基因组DNA用已知的限制性内切酶消化，电泳经Southern印迹后，用放射性同位素或非放射性物质标记探针，与转移于支持膜上的DNA杂交，经放射自显影显示出基因组DNA中与探针同源的DNA序列片段的大小。RFLP标记呈共显性，标记准确，不影响表型，数目也较多，但其分析程序复杂，有放射性污染，技术难度大，费时，成本较高，需要的DNA量较大，难以大范围推广应用。1990年，Williams等(Williams J G，Kubelik A R，Livak K J，Rafalski J A，Tingey S V.DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers.Nucleic Acids Res，1990，18(22)：6531-6535)和Welsh等(Welsh J，McClelland M.Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primer.Nucleic Acids Res，1990，18(24)：7213-7218)几乎同时将PCR技术应用于分子标记，发展出一种新型的分子标记技术RAPD，该方法是用短的(通常为10bp)随机序列DNA作为引物，对目的基因组DNA进行PCR扩增而产生多态性。RAPD技术快速、简便、成本低廉。但随着研究的深入，人们发现该技术存在一定的缺陷：RAPD为显性标记，不能提供完整的信息；易受实验条件影响；稳定性差；结果不能区分纯合体和杂合体。1989年Tautz提出了SSR分子标记方法(Rautz D.Hypervariability of simple sequences as a general source for polymorphic DNA markers.Nucleic Acids Research，1989，17：6463-6471)，该方法是根据微卫星DNA两端的单拷贝序列设计一对特异引物，利用PCR技术，扩增每个位点的微卫星DNA序列，通过电泳分析核心序列的长度多态性。SSR具有很好的稳定性和多态性，DNA用量少，重复性高。但要获得SSR引物需要进行大量克隆、测序和杂交验证工作。1992年，Vos等人把RAPD和RFLP技术结合起来，发明了新的分子标记AFLP技术(Vos P，Hogers R，Bleeker M，Reijans M，van de Lee T，Hoernes M，Frijters A，Pot J，Peleman J，kuiper M，Zabeau M.AFLP：a new technique for DNA fingerprinting.Nucleic Acids Res.1995，23：4407-4414)，该发明于1993年获欧洲专利局专利，专利号为EP0534858A1。该法先设计针对某种限制性内切酶的通用接头，以及可与接头序列和限制性酶切位点的序列配对的专用引物，用上述内切酶消化基因组DNA，将通用接头与限制性片段两端连接，再用专用引物扩增，最后电泳显示结果。AFLP具有标记多态性强、准确性高、重复性好以及可用于没有任何分子生物学研究基础的物种等优点，很快被推广到生物学的各个领域。但也存在明显的缺点：技术繁琐、过程时间长、检测的不是等位片段、费用昂贵，且AFLP标记是显性标记，不能提供完整信息。1996年，Lander提出了SNP技术(Lander E S.The new genomics：Global views of biology.Science，1996，274：536-539)，SNP数量最为丰富，其遗传稳定性远高于SSR，可以进行快速、规模化筛查，易于基因分型，正成为一种极具应用潜力的新型分子标记。SNP既可以用PCR，又可以用DNA芯片来检测，但目前对SNP的检测在技术上还显得太复杂，难度较大，因而还难以广泛应用。