[发明专利]ActA促进减数分裂前雌性生殖细胞体外发育的技术方法

权利要求书

1.一种ActA促进减数分裂前雌性生殖细胞体外发育的技术方法，其特征在于利用机械法分离12.5dpc雌性胎鼠生殖嵴，体外培养胎鼠生殖嵴后收集卵母细胞，将12.5dpc减数分裂前的生殖细胞利用体外培养的方法分化发育成生发泡期卵母细胞并诱导成熟，得到成熟的卵母细胞；并利用体外受精技术检测体外发育形成的卵母细胞质量，获得早期发育的体外受精后代。

2.根据权利要求1所述的ActA促进减数分裂前雌性生殖细胞体外发育的技术方法，其特征在于胎鼠生殖嵴的分离按照如下步骤操作：胎鼠卵巢来源于12.5dpc的孕鼠，孕鼠的判定以见栓为0.5dpc，出生后小鼠的卵巢来源于12～14dpp的小鼠，利用机械分离法从胎鼠体内分离出卵巢，并转移到磷酸盐缓冲液+10％胎牛血清的操作液中，在操作液中洗3次，并利用手术镊子去掉与卵巢连接在一起的中肾组织，在由密理博高糖培养基；5％胎牛血清；1％丙酮酸钠；1％青链霉素；10mIU促卵泡素配制成的新鲜培养液中将卵巢洗3次。

3.根据权利要求1所述的ActA促进减数分裂前雌性生殖细胞体外发育的技术方法，其特征在于胎鼠生殖嵴的体外培养按照如下步骤操作：生殖嵴分离出来培养的当天定为0天，分离出的12.5dpc胎鼠生殖嵴，一分为二，并在培养液中贴壁培养28天，组织在37℃、5％CO₂、饱和湿度的培养箱里培养，培养液每两天换半液，培养液A包含密理博高糖培养基；10％胎牛血清；1％丙酮酸钠；1％青链霉素；10mIU促卵泡素；100ng/ml ActA；培养液B包含密理博高糖培养基；5％胎牛血清；1％胰岛素转铁蛋白亚硒酸钠复合物；1％丙酮酸钠；1％青链霉素；100mIU/ml促卵泡素；1ng/ml上皮生长因子；100ng/ml ActA。

4.根据权利要求1所述的ActA促进减数分裂前雌性生殖细胞体外发育的技术方法，其特征在于卵母细胞的收集按照如下步骤操作：收集添加ActA体外培养到28天的小鼠卵巢，并撕成碎小的组织块，0.25％胰酶，0.2％胶原酶IV和0.02％ DNAse-I消化，37℃处理10min，加入胶原酶等体积的胎牛血清终止消化，洗涤3次后，用口吸管收集裸卵，在磷酸盐缓冲液中反复洗涤，直至收集的样品中不再含有颗粒细胞。

5.根据权利要求1所述的ActA促进减数分裂前雌性生殖细胞体外发育的技术方法，其特征在于卵母细胞的培养及成熟诱导按照如下步骤操作：使用口吸管吸出卵母细胞，然后挑出直径在75μm以上的卵母细胞，每个液滴20个卵母细胞放入培养24h后的颗粒细胞层上，12～14dpp腔前卵泡颗粒细胞收集后放入提前做好的培养液滴中，培养液配方：密理博高糖培养基；10％胎牛血清；1％胰岛素转铁蛋白亚硒酸钠复合物；促卵泡素10mIU/ml；上皮生长因子5ng/ml；ActA 100ng/ml；1％丙酮酸钠；1％青链霉素；6cm培养皿，每个液滴100μl，37℃，5％CO₂、饱和湿度的培养箱里培养过夜；共培养7天后，取出卵母细胞， 挑出没有凋亡的卵母细胞，以每个液滴20个，放入提前做好的成熟培养液培养滴中，6cm培养皿，每个液滴100μl，37℃，5％CO₂、饱和湿度的培养箱里培养过夜，在37℃，5％CO₂，饱和湿度的培养箱里培养18小时，统计卵母细胞成熟的比例；成熟培养液的配方为：密理博高糖培养基；10％胎牛血清；1％胰岛素转铁蛋白亚硒酸钠复合物；促卵泡素100mIU/ml；上皮生长因子1ng/ml；1％丙酮酸钠；1％青链霉素。