[发明专利]ActA促进减数分裂前雌性生殖细胞体外发育的技术方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种激活素A(ActA)促进减数分裂前雌性生殖细胞体外发育的技术方法，特别是涉及一种将12.5dpc(交配后的天数)减数分裂前的生殖细胞利用体外培养的方法分化发育成生发泡(GV)期卵母细胞并诱导成熟，利用体外受精技术检测体外发育形成的卵母细胞质量，获得早期发育的体外受精后代的方法。属于生殖医学的生物医学技术领域。 

背景技术：

在先前的研究中，来源于小鼠减数分裂前的生殖细胞不能恢复减数分裂并发育到MII期。在雌性小鼠胚胎中，13.5dpc生殖细胞经历了进一步的DNA复制，并且进入第一次减数分裂的前期。然而，来源于胎儿生殖细胞的卵母细胞体外生长仅仅能进入到第一次减数分裂的双线期，并停滞在这一时期。研究人员发现，小鼠11.5～12.5dpc的生殖嵴分离获得的PGCs在没有体细胞的支持下不能存活，而是快速的凋亡，而利用小鼠胎儿肺细胞与生殖细胞聚合后体外培养，生殖细胞可以像在卵巢里的发育进程一样进入第一次减数分裂。如果进入雌性生殖嵴的生殖细胞数量过少，颗粒细胞的分化可以被启动，但是很快就失去了分化能力，卵母细胞也随后死亡或数量减少。卵母细胞与颗粒细胞间的的互作是双向的，这种互作调控了这两种类型细胞的发育，它不仅是卵母细胞发育必需的，也是卵泡发育所必需的，从原始卵泡的形成到成熟卵泡的排卵始终都有互作的存在。最近，科学家建立了一种生殖细胞与体细胞的共培养方法，并结合KITL、bFGF和LIF等因子的作用，可以使从雌性胎鼠生殖嵴中分离出来的PGC体外发育到卵母细胞第一次减数分裂的双线期，但这种卵母细胞不能成熟和受精。 

Obata和Niwa等利用12.5dpc胎鼠完整的卵巢进行体外培养28d，但获得的卵母细胞不能完成第二次减数分裂。可能是多种因素制约了卵母细胞的体外发生。一种原因可能是卵母细胞核、质发育不同步，而核质同步发育成熟又是卵母细胞恢复减数分裂成熟必需的。另一方面，卵泡颗粒细胞与卵母细胞间的间隙连接也影响着卵母细胞的发育，间隙连接形成不完全会阻碍卵母细胞的减数分裂恢复。还有一种原因就是体外发育的卵母细胞不能达到最大直径的80％，而这是卵母细胞成熟发育所需的。利用生殖细胞体外培养的方法难以克服这些问题，因为至今对卵母细胞生长、卵泡内颗粒细胞与卵母细胞间隙连接的形成、卵母细胞的减数分裂启动等调控机理知之甚少。 

发明内容：

本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种ActA促进减数分裂前雌性生殖细胞体外发育的技术方法。 

为了实现上述发明目的，本发明利用机械法分离12.5dpc雌性胎鼠生殖嵴，体外培养胎鼠生殖嵴后收集卵母细胞，将12.5dpc减数分裂前的生殖细胞利用体外培养的方法分化发育成GV期卵母细胞并诱导成熟，得到成熟的卵母细胞；并利用体外受精技术检测体外发育形成的卵母细胞质量，可获得早期发育的体外受精后代。 

所述胎鼠生殖嵴的分离按照如下步骤操作：胎鼠卵巢来源于12.5dpc的孕鼠，孕鼠的判定以见栓为0.5dpc。出生后小鼠的卵巢来源于12～14dpp的小鼠。利用机械分离法从胎鼠体内分离出卵巢，并转移到磷酸盐缓冲液(PBS)+10％FCS的操作液中，在操作液中洗3次，并利用手术镊子去掉与卵巢连接在一起的中肾组织，在新鲜培养液(密理博高糖培养基(α-MEM)；5％胎牛血清(FCS)；1％丙酮酸钠；1％青链霉素；10mIU促卵泡素(FSH))中将卵巢洗3次。 

所述胎鼠生殖嵴的体外培养按照如下步骤操作：生殖嵴分离出来培养的当天定为0天。分离出的12.5dpc胎鼠生殖嵴，一分为二，并在培养液中贴壁培养28天。组织在37℃、5％CO₂、饱和湿度的培养箱里培养，培养液每两天换半液，换液时观察卵母细胞的发育情况等。此处所用的培养基分为两种培养液，培养液的配方如下： 

培养液：培养液A包含密理博高糖培养基(α-MEM)；10％胎牛血清(FCS)；1％丙酮酸钠；1％青链霉素；10mIU促卵泡素(FSH)；100ng/ml激活素A(ActA)；培养液B包含α-MEM；5％FCS；1％胰岛素转铁蛋白亚硒酸钠复合物(ITS-mix)；1％丙酮酸钠；1％青链霉素；100mIU/ml FSH；1ng/ml上皮生长因子(EGF)；100ng/ml ActA。