[发明专利]用于检测EGFR外显子21多态性的引物组及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及用于检测EGFR外显子21多态性的引物组以及所述引物组的应用。

背景技术

已经认为表皮生长因子受体(EGFR)在肺癌中起重要作用。能够阻抑(suppress)EGFR功能的药物已被用于肺癌治疗的领域。被用于治疗非小细胞肺癌患者的EGFR酪氨酸激酶抑制剂(如吉非替尼(gefitinib)、埃罗替尼(erlotinib)等等)作为此类药物已知。这些药物不仅被用于肺癌，也被尝试用于腺癌。然而，在一些患者组中，EGFR酪氨酸激酶抑制剂的效果有时似乎不够。另外，在另一组患者中，尽管EGFR酪氨酸激酶抑制剂在开始诱导反应，但是存在EGFR酪氨酸激酶抑制剂的效果逐渐降低的情况，这与预期相反。

因为这些原因，已针对抑制剂的使用研究了预测EGFR酪氨酸激酶抑制剂效果的因素，并已发现EGFR基因突变是此类重要因素。已知的预测性因素的例子包括EGFR外显子在密码子790处的突变(T790M)(JP2008-529532，Cancer Research，Vol.66，No.16，2006，pp.7854-7858)，外显子18在密码子719处的突变(G719X)(Cancer Research，Vol.66，No.16，2006，pp.7854-7858)。

EGFR外显子21在密码子858处由亮氨酸到精氨酸的突变(EGFR外显子21L858R)已被明确地认为能增强吉非替尼的肿瘤减小效应。因为在高百分比(约45％)的肺癌中发现了EGFR突变，所以EGFR突变作为在给药前要考虑的预测性因素来说是重要的。

直接测序方法(J.Clin.Oncology，Vol 23，No 11(April 10)，2005：pp.2513-2520)或SMAP(SMart-Abplification Process)方法(Clin Cancer Res2007；Vol.13(17)September 1，2007：pp.4974-4983)已知是检测EGFR外显子21L858R的技术。

同时，突变检测方法已知是容易、灵敏并且可靠的检测突变的方法，该方法包括，通过在一个反应中既使用突变型又使用野生型(正常型)引物，来优先扩增具有突变的碱基的核酸序列(WO 2010/001969)。

发明内容

实际测试中使用的样品是来自血浆或血清的可溶的DNA。在此类DNA中检测突变需要高特异性。然而，在直接测序方法中，特异性通常被认为是约10％，这可能不足以检测可溶DNA中的突变。同时，尽管SMAP方法在灵敏度的角度来看可能是足够的，但是对材料(例如引物)的设计可能不容易，实际的操作可能是复杂的。

考虑这些情况进行了本发明。本发明涉及提供下述探针以及所述探针的应用，所述探针能够以高灵敏度容易地检测EGFR外显子21多态性的探针。

本发明第一方面的一个示例性实施方式是[1]：用于检测EGFR外显子21中多态性的引物组，所述引物组包含P1寡核苷酸和P2寡核苷酸，并且能够通过使用SEQ ID NO：1中的区域作为模板进行扩增，所述区域包含SEQ ID NO：1的第172792个碱基，

P1寡核苷酸具有10个碱基到50个碱基的长度，并且具有胞嘧啶作为与SEQ ID NO：1的第172792个碱基互补的碱基，

P2寡核苷酸具有10个碱基到50个碱基的长度，并且具有腺嘌呤作为与SEQ ID NO：1的第172792个碱基互补的碱基，和

P1寡核苷酸和P2寡核苷酸满足下述相关性中的至少一种：P1寡核苷酸的解链温度高于P2寡核苷酸的解链温度；或P1寡核苷酸比P2寡核苷酸长一个或多个碱基。

本发明的第一方面的另一个示例性实施方式是[2]：[1]的引物组，其中P1寡核苷酸或P2寡核苷酸中的至少一个在不同于与SEQ ID NO：1的第172792个碱基互补的碱基位置的位置包含至少一个与SEQ ID NO：1的碱基序列不互补的碱基。

本发明的第一方面的另一个示例性实施方式是[3]：[1]或[2]的引物组，其中P1寡核苷酸或P2寡核苷酸中的至少一个在不同于与SEQ ID NO：1的第172792个碱基互补的碱基位置的位置包含额外的序列，所述额外的序列由连续的2到10个与SEQ ID NO：1的碱基序列不互补的碱基形成，并且位于所述寡核苷酸链的5′末端。