[发明专利]一种GLP-1衍生物DLG3312及其固相化学合成方法

说明书

技术领域

本发明属于生物、化学工程技术领域，具体地涉及一种具有人胰高血糖素样肽-l(GLP-1)活性的GLP-1衍生物DLG3312及其固相化学合成方法。

背景技术

1929年，Zunz和Labbare将-类从肠道中分离出来的、可以促进葡萄糖刺激胰岛素分泌的体液因子命名为肠降糖素(incretin)，GLP-1是其中的主要成分。GLP-1是由肠道L细胞分泌的胰高血糖素前原基因的产物，其在食物摄入后分泌。体内主要存在两种生物活性形式：GLP-1（7~36）amide和GLP-1（7~37），GLP-1约80%的循环活性来自前者。GLP-1作为一种激素，通过刺激分泌胰岛素降低餐后血糖，同时抑制胰高血糖素的分泌。并且，其具有抑制胃肠道食物的清空和食物的摄入，此外，其能够引起胰岛β细胞的增殖。

GLP-1适用于二型糖尿病的治疗，其降低血糖的效应是血糖依赖性的，当血糖浓度高于6mmol/L时，GLP-1显著促进胰岛素分泌，而一旦血糖恢复至正常值则不再继续发挥降糖作用，所以在用药过程中不会出现低血糖。通过长期治疗，能够有效改善二型糖尿病患者的糖化血红蛋白量，对二型糖尿病的预防和治疗具有良好的应用前景。

在实际应用中，根据以往研究结果，GLP-1进入体内后的半衰期为2分钟，其原因在于体内的多种蛋白酶对GLP-1的降解，目前DPP-4是其中最主要关注的酶。为抵抗此酶对GLP-1的降解，延长在体内的药效时间，已有多种方法，如氨基酸的定点突变、分子修饰等。如CJC-1131使GLP-1半衰期延长至18小时，其通过化学合成利用接头分子将多肽与血浆蛋白相连接而大大延长半衰期；LY315902是在GLP-1上连接1个8C脂肪链，在狗体内半衰期为3-6小时；利拉鲁肽（Liraglutide），其于GLP-1的26位的赖氨酸处连接1个16C脂肪酸侧链，并将34位突变为赖氨酸，在人体内半衰期为8小时；PEG修饰后的GLP-1比天然GLP-1血浆半衰期要长40倍等。

虽然通过对GLP-1的序列进行改造能够延长药效时间，但是由于改造后的分子与天然GLP-1的同源率低，差异较大导致不同程度的副作用，如过敏、呕吐、胃肠不适等。

现有技术中已有采用DNA重组技术制备GLP-1衍生物，名称为“一种人胰高血糖素样肽-1衍生物及其制备和应用”发明专利（200610024355.X）中存在以下缺点：利用大肠杆菌作为GLP-1衍生物表达的宿主菌，在后续纯化过程中，需要检测和控制大肠杆菌内毒素以及大肠杆菌DNA的残留量，增加了生产步骤和成本。

GLP-1在体内有两种形式，一种为GLP-1(7-36)amide，由30个氨基酸残基组成，另一种为GLP-1(7-37)，由31个氨基酸残基组成，二者均有生物学活性。本发明涉及的GLP-1指GLP-1(7-37)，其序列如下：HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG。

本发明改进了GLP-1序列及结构，提出了一种GLP-1衍生物DLG3312及其固相化学合成方法。本发明提出的GLP-1衍生物DLG3312解决了天然GLP-1体内活性时间短的问题，且具有良好生物学活性，其原因主要在于：本发明GLP-1衍生物DLG3312的结构X-Y-X中，X与Y的连接方式为2个X的碳端羧基分别与Y的2个氨基缩合连接，形成由2个X与1个Y构成的特定结构的U型同源二聚体。本发明中，二聚体与受体的亲和力相对于单体有较大提高，从而能够更为有效地激活受体；二聚体中包含突变的氨基酸，同时，二聚结构就其本身而言，能阻碍与体内多种酶与其的结合，从而降低对其的降解速率；二聚体与单体相比，具有相对较大的分子量，由此相对延长因肾小球滤过作用对其清除的时间，使之在体内停留时间增加，延长药效时间。并且，在安全性方面也避免了目前所使用的多种糖尿病药物具有的副作用，如造成低血糖、体重增加，引起胰岛素抵抗、胰岛β细胞衰竭等等。相反的，本发明DLG3312具有改善胰岛素抵抗和抑制胰岛β细胞凋亡的功能，从根本改善糖尿病病人的糖代谢能力。另外，现有技术制备GLP-1衍生物方法中存在步骤多、成本高等缺陷，而本发明提出的制备方法具有操作简便、成本低廉等优势，具有更大的应用潜力。

发明内容