[发明专利]一种温敏型亲属螯合亲和沉淀剂的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于蛋白质亲和沉淀剂的制备领域，特别涉及一种温敏型亲属螯合亲和沉淀剂的制备方法。

背景技术

生物物质，特别是酶和抗体等蛋白质，具有识别特定物质并与该物质的分子相结合的能力，这种识别并结合特定分子的能力具有排他性，即生物分子能够区分结构和性质非常相近的其他分子，选择性地与其中某一种分子相结合。这种生物物质间的特异性相互作用即为亲和作用(affinity)。利用生物分子间的亲和作用的原理进行生物物质分离纯化的技术称为亲和分离(affinity separation)或亲和纯化(affinity purification)

金属螯合亲和纯化是一种利用过渡金属离子(Cu²⁺、Ni²⁺、Zn²⁺或Co²⁺)和蛋白质上的电子供体基团之间的亲和作用分离纯化蛋白质的方法。早在1948年，就有研究发现水溶液中的His和Cys可以与Cu²⁺、Ni²⁺形成稳定的复合物。后续研究表明，蛋白质中的His残基的咪唑基、Cys残基的巯基、Try残基的吲哚基和Arg残基的胍基都是很强的电子供体，当蛋白质上的这些氨基酸残基暴露在水溶液中时，蛋白质可以结合在固定在凝胶上的金属离子Cu²⁺或Ni²⁺上。

N-乙烯基己内酰胺(NVCL)的高聚物聚(N-乙烯基己内酰胺)简称PNVCL，一种具有最低临界溶液温度(LCST)特性的热敏性智能聚合物材料，由于其大分子侧链上同时具有亲水和疏水基团，使PNVCL的水溶液随着外界温度的变化可在其LCST附件发生可逆相变。其相变温度在人体生理温度(30～40℃)附近，具有良好的离子型水溶性、热敏性以及生物相容性，因而在药物控释、酶固定化、免疫分析、生化分离等领域有潜在的应用价值。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种温敏型亲属螯合亲和沉淀剂的制备方法，该方法操作简单，所使用的聚合物可回收利用，有效降低蛋白质分离纯化成本，适合规模化生产；所制备的温敏型亲属螯合亲和沉淀剂，操作简单，反应时间短，蛋白吸附效果好。

本发明的一种温敏型亲属螯合亲和沉淀剂的制备方法，包括：

(1)将0.25～2.0g N-乙烯基己内酰胺与25～300μl甲基丙烯酸溶解在去离子水中，得混合液，然后将所述的混合液置于反应容器中，真空脱气，再加入0.1～0.60ml含有0.01～0.06g过硫酸铵的过硫酸铵水溶液，并调节体系pH值至7.0，通氮气鼓泡后密封后，在50～70℃反应1～3h；反应结束后加入氯化钠溶液沉淀，收集反应生成的沉淀，得到温敏聚合物PNVCL-co-MAA聚合物；

(2)用Tris-HCl缓冲液将上述温敏聚合物PNVCL-co-MAA配制成浓度为0.05～0.10g/ml的PNVCL-co-MAA的Tris-HCl缓冲液溶液，然后加入浓度为0.1～0.6mol/L硫酸铜溶液，在室温下振荡反应0.5～2h，收集反应生成的沉淀，得到亲和温敏聚合物PNVCL-co-MAA-Cu，即为该温敏型亲属螯合亲和沉淀剂。

步骤(1)中所述的N-乙烯基己内酰胺的质量为0.5～1.5g，甲基丙烯酸的用量为50～150μl。

步骤(1)中所述的真空脱气是时间为10～30min，氮气鼓泡的时间为15～30min。

步骤(1)中所加入的过硫酸铵水溶液中过硫酸铵的含量为0.03～0.05g。

步骤(1)中所述的调节体系pH值至7.0为采用浓度为1mol/L的氢氧化钠水溶液调节。

步骤(1)中所述的氯化钠溶液的浓度为0.2mol/L。

步骤(2)中所述的Tris-HCl缓冲液为0.05mol/L、pH值为4.0～8.0的Tris-HCl缓冲液。

上述Tris-HCl缓冲液的pH值为5.0～7.0。

步骤(2)中所加入的硫酸铜溶液浓度为0.2～0.4mol/L，室温反应时间为1～1.5h。

步骤(2)中所述的硫酸铜溶液与PNVCL-co-MAA的Tris-HCl缓冲液溶液的体积比为5～10∶5～10。

步骤(2)中所得的温敏型亲属螯合亲和沉淀剂应用于牛血清蛋白BSA的亲和沉淀纯化。

本发明的PNVCL-co-MAA-Cu的合成路线，如下