[发明专利]一种检测转绿色荧光蛋白基因及启动子的PCR方法

权利要求书

1.一种检测转基因羊绿色荧光蛋白基因及启动子的PCR方法，其特征在于：针对转基因羊，依据GFP基因序列和pLEX载体CMV启动子序列，设计两对特异性引物，其一为GFP-上游引物： TAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTC；GFP-下游引物: AGGACCATGTGATCGCGCTTCT;其二为CMV-上游引物：TCCCATAGTAACGCCAATAG;CMV-下游引物：GCTTATATAGACCTCCCACCGTACA；以转基因羊基因组DNA为模板，扩增的GFP基因的片段为595bp；扩增的CMV基因的片段为421bp；

其中DNA模板的提取：

1）取羊脐带组织的碎块100μg，依次加入0.5mL的裂解液；10mmol/LTris-Cl，pH7.5；1mmol/L EDTA，pH7.5；0.1％（m/V）SDS；消化前加入100mg/mLRNA酶15μl、10mg/mL蛋白酶K 15μl，不停地摇动，在55℃下消化58-63分钟待用；其中裂解液的配方：取10mmol/L Tris-Cl，pH7.5；1mmol/L EDTA，pH7.5；0.1％（m/V）SDS；100mg/mLRNA酶；10mg/mL蛋白酶K，置于试剂瓶中混合均匀即可；

2）取上步消化物，加入0.5mL的酚、氯仿、异戊醇的混合液，其混合比为25:24:1，混合均匀后置于室温下静置4-5分钟，12000转/分钟、离心8-10分钟，取上清液，用0.5mL氯仿抽提一次，室温下静置5-6分钟，12000转/分钟、离心10-12分钟待用；

3）取上步上清液加入两倍体积的无水乙醇，室温静置7-10分钟,沉淀DNA； 经12000转/分钟、离心9-11分钟，用1mL 70％乙醇洗涤1次；12000转/分钟、离心1.5-2.0分钟，弃上清，室温静置干燥7-12分钟；加入50μl TE，即为10mmol/L Tris-Cl, pH7.4；1 mmol/L EDTA，pH 8.0；溶解DNA，4℃贮存备用；

其中PCR反应体系：

50μl反应体系为:10×PCR Taq Buffer 5μl ;25mM MgCl₂                     4μl ;dNTP Mix(2.5mM each ) 5μl ; 引物(10pM/μl)各 0.5μl; DNA模板 100μg/mL 6μl ;Taq DNA Polymerse 1.25μl ; Nuclease-free Water  26.75μl;总体积为50μl；

其中 PCR反应条件：

94℃预变性5分钟，94℃变性30秒，61℃退火30秒，72℃延伸30秒，35个循环；72℃延伸7分钟；

其中琼脂糖凝胶电泳检测：

PCR扩增产物在2％的琼脂糖凝胶中电泳，电压80V，电泳结束、凝胶成像，在595bp和421bp处出现清晰条带。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：选用的Tris-Cl为三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液，EDTA为乙二胺四乙酸，SDS为十二烷基磺酸钠，GFP为绿色荧光蛋白，均购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；RNA酶购自上海生物工程有限公司；蛋白酶K 购自Amerisco公司。