[发明专利]一种检测转绿色荧光蛋白基因及启动子的PCR方法

说明书

技术领域

 本发明涉及一次同时检测转基因羊两种基因结构的PCR方法，特别针对携带两种外源基因的转基因羊的检测，与常规方法相比，双重PCR方法不仅可节约样本材料，而且可以降低检测成本。

背景技术

转基因动物是指人工地把外源基因导入动物的受精卵(或早期胚胎细胞)，使之与动物本身的基因组整合在一起，因而外源基因能随细胞的分裂而增殖，并能稳定地遗传给下一代的一类动物。开展家畜转基因新品种培育，需高度重视转基因家畜的生物安全性。因此，对转基因羊外源基因结构的检测是进行安全评价必不可少的。转基因羊外源基因结构检测包括调控元件如启动子、增强子、标记基因、报告基因等的检测和目的基因检测。

绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein，GFP)是一类存在于腔肠动物体内的生物发光蛋白，其内源性荧光基团在受到紫外或蓝光激发时可发现清晰可见的绿光；由于检测方便，对生物体基本没有毒性，在很多领域已有取代LacZ，荧光素酶等传统标记方法的趋势，在制作转基因动物过程中更是如此。由于直接检测外源基因在动物体内的表达和分布常常是困难的，因此在制作转基因动物时，一般在目的基因旁边加上一段表达产物易于检测的标记基因（如GFP），由于 GFP发光时不需底物，能对活体进行检测等优点，已作为一种报告基因得到广泛应用。

启动子是指位于转录起始位点上游、确保转录精确而有效起始的DNA序列，是结合RNA聚合酶并形成转录起始复合物的区域，通常还包括促进这一过程的调节蛋白质结合位点。CMV启动子可在多数动物细胞和组织中高效表达，在转基因上已被用于多种功能蛋白或标记基因的启动子，因此对转基因羊进行标记基因GFP和CMV启动子的检测非常必要。

文献检索披露;①冯湘玲等在《生命科学研究》2001，5(4):339-341.）发表的“一种快速检测启动子特异性的方法”的论文，揭示了利用绿色荧光蛋白(GFP)的特性, 与不同的基因启动子连接，并运用显微注射技术制备转基因蟾。根据GFP表达情况，可初步判断启动子的特异性。②纪喜文等在《化学与生物工程》2010，27(9).）上发表的“一种新型转基因斑马鱼毒物检测系统的建立”的论文，揭示了利用转基因技术成功建立一套绿色荧光蛋白( GFP) 转基因斑马鱼毒物检测系统。选用芳香烃反应元件AH RDtk 片段和 pFRMwg+ plasmid 载体，通过酶切、连接和 PCR 鉴定等程序成功构建载体 DNA，然后通过显微注射转入斑马鱼，经不断传代和筛选得到稳定的、受芳香烃反应元件AHRDtk 控制的转基因斑马鱼。③王趁芳等在《畜牧兽医学报》.2009，40(2):185-190.）上发表的“转基因小鼠的多重PCR快速检测技术“的论文，揭示了采用碱裂解法快速提取鼠尾基因组 DNA，用 PCR方法检测其中的外源基因结构如 cytomegalovirus (CMV)启动子、 hGH polyA 终止子及目的基因跨膜蛋白 66 ( Transmembrane protein 66，Tmem66) ,筛选到阳性样品。优化了多重 PCR 引物退火温度及缓冲液浓度，并探讨了扩增速率对多重 PCR 的影响。④专利名称为《转红色荧光蛋白基因唐鱼聚合酶链式反应检测方法》，公开号为CN 101906477A的发明，公开了它根据转红色荧光蛋白基因唐鱼外源红色荧光蛋白基因序列设计引物，建立了快速、有效的能特异性检测转红色荧光蛋白基因唐鱼的PCR方法。披露的已有技术与本发明有显著差异。

本发明通过慢病毒卵周隙注射，制备了转绿色荧光蛋白基因绵羊，采用苯酚氯仿抽提法快速提取羊尾基因组 DNA，用双重PCR方法同时检测标记基因GFP和其中的CMV启动子，得到很好的扩增效果；此转基因检测技术的标准化也将为我国转基因羊的检测、生物安全评价、相关法律法规的制定提供科学依据和技术支撑。

发明内容

本发明的目在于：提供检测转基因羊的PCR方法，特别针对GFP基因及CMV启动子的特异检测；双重PCR方法为我国转基因羊和转基因羊生物安全评价提供科学依据 。