[发明专利]从诸葛菜中提取抗菌肽的方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种从诸葛菜中提取对真菌有抑制效果的抗菌肽的方法。

背景技术：

目前，所有的常规抗生素都出现了相应的抗药性致病株系，致病菌的抗药性问题已经日益严重地威胁着人们的健康。另一方面，长期以来，人们一直通过在动物饲料中添加抗生素、抗菌药物类生长促进剂来控制腹泻、维持健康、促进生长及提高饲料利用率。但是大量使用抗生素、抗菌药物在抑制病原微生物的同时，也抑杀了动物体内生理性微生物，破坏了微生物种群或群落间相互制约的微生态平衡，从而导致动物，特别是幼龄动物对病原微生物的易感性，因此，寻找全新类型的抗生素替代品，生产出既能防止畜禽疾病发生，促进生长，副作用又小、无残留、无耐药性的绿色饲料添加剂和药品，是解决现有化学抗生素副作用的一条有效途径。

研究发现，抗菌肽具有代替传统抗生素的潜力，其优点表现在：抗菌活性高，抗菌谱广，种类多，可供选择的范围广，靶菌株不易产生抗性突变；无免疫原性，对人畜无毒副作用；具有良好的溶解性和热稳定性；对较高的离子强度或较大的pH变化具有较好的耐受性，甚至有抵抗消化道多肽酶水解的能力。因此，抗菌肽越来越受到研究人员的关注，而被认为将会在医药工业和饲料添加剂上有着广阔的应用

前景。天然抗菌肽是生物细胞特定基因编码、经特定外界条件诱导产生的一类多肽，通常是由30多个氨基酸残基组成的碱性小分子多肽，水溶性好，分子量大约为4000道尔顿左右，是一种非特异性免疫分子，同时也是体液免疫防卫系统中的重要成员，在抵御外来病原体致病过程中起重要作用。具有明显的对真菌、病毒、原虫的杀伤作用，同时又可以促进伤口的愈合（可能是加速了创伤处细胞的分裂增殖），能攻击肿瘤细胞而对正常细胞没有作用。根据抗菌肽的来源可将其分为三类：动物抗菌肽、植物抗菌肽和细菌抗菌肽。

自1972年瑞典科学家Baman首先发现抗菌肽以来，科学家们已经在昆虫、被囊动物、两栖动物、鸟类、鱼类、哺乳动物、植物乃至人类等多种生物体中发现并分离得到了300多种内源性抗菌肽。经过十几年的努力，华南农业大学教授黄自然及其研究组从我国特有物种柞蚕蛹中经人工诱导和提取的产物（溶菌酶）--抗菌肽，取得了首创性科研成果。　南开大学、天津大学和大港油田联手攻关，成功地从苍蝇体内分离出抑制多种病源菌和病毒的抗菌肽。目前多种抑菌实验已经完成，科研人员正在着手进一步纯化从苍蝇幼虫体内提取出的抗菌肽。中国水稻所黄大年教授主持的蚕抗菌肽B基因转化水稻的研究，抗菌肽B基因转化植株表现出对白叶枯病合细条病的抗性有明显提高,为水稻白叶枯病的抗性育种提供了一条新的途径.目前，已有多种抗菌肽抗生素正在进行临床前的可行性研究，其中magainins已经进入三期临床试验阶段。

但抗菌肽要大量生产应用，目前还需要解决一些问题。首先是来源问题。由于昆虫抗菌肽的天然资源有限，化学合成和基因工程便成为获取抗菌肽的主要手段。化学合成肽类，成本较高。而通过基因工程，在微生物中直接表达抗菌肽基因，可能造成宿主微生物自杀而不能获得表达产物。以融合蛋白的形式表达抗菌肽基因，虽然可以克服这一缺点，但融合表达后抗菌肽独特的N-端和C-端结构很难保持完整的天然的空间构象，使活性受到较大影响。因此提取天然的活性抗菌肽仍是最切实可行的方法。另一方面，国内的抗菌肽研究主要集中在动物和微生物源抗菌肽上，对植物源抗菌肽研究相对较少。

发明内容：

本发明的目的是提供一种适合提取诸葛菜中的抗菌肽的高效分离纯化方法。

本发明诸葛菜抗菌肽提取及分离方法通过以下步骤实现：

（1）诸葛菜蛋白粗提液的制备。将诸葛菜研磨成浆，加入可溶蛋白提取缓冲液，在3—5℃浸提、过滤、离心分离滤液，弃沉淀，取上清液；

 （2）粗蛋白沉淀、脱盐。将上清液边搅拌边加入（NH4）2SO4至饱和度35—45%、3—5℃静置、离心分离，再得上清液，加入（NH4）2SO4至饱和度75—85%，静置，离心分离，将沉淀溶于离子交换层析缓冲液Ⅰ中，得蛋白质粗提液；

（3）离子交换层析。将蛋白质粗提液上用洗脱液平衡好的离子交换层析柱，用离子交换层析缓冲液Ⅰ淋洗至基线，再用离子交换层析缓冲液Ⅱ进行洗脱，检测抑菌活性收集活性组分；

（4）抗菌肽的纯化。将活性组分用离子交换层析缓冲液Ⅰ透析，再用凝胶过滤缓冲液作透析，然后抽真空浓缩，将浓缩液上分子筛层析柱，用凝胶过滤缓冲液洗脱，检测抑菌活性收集活性组分，冷冻干燥得抗菌活性物质干粉。