[发明专利]检测谷胱甘肽作用于氧化葡糖杆菌过程中细胞内蛋白质变化的方法

权利要求书

1.一种检测谷胱甘肽作用于氧化葡糖杆菌过程中细胞内蛋白质变化的方法，其特征是包括如下步骤：

(1)细胞内蛋白质的测定：

①细胞收集及淬灭：

取3-5份氧化葡糖杆菌以8％～16％的体积比分别接种到发酵培养基A中，另取3-5份所述氧化葡糖杆菌以8％～16％的体积比分别接种到发酵培养基B中，将两种接种后的培养基在28℃～32℃，转速为200～250rpm的条件下培养发酵，在发酵过程中选取1h、15h为取样点取出发酵液样品，在4℃下，以4000～6000rpm的转速离心，收集下层的细胞，并用pH为7.2～7.4的磷酸盐缓冲液清洗，用液氮淬灭，终止代谢反应；用液氮研磨破碎细胞，获得3-5份从培养基A中发酵1h收集淬灭的破碎细胞，3-5份从培养基A中发酵15h收集淬灭的破碎细胞，3-5份从培养基B中发酵1h收集淬灭的破碎细胞，3-5份从培养基B中发酵15h收集淬灭的破碎细胞；

所述发酵培养基A为：80g·L^-1山梨糖，20g·L^-1玉米浆，1g·L^-1 KH₂PO₄，0.2g·L^-1MgSO₄，和12g·L^-1尿素，余量为水；

所述发酵培养基B为：80g·L^-1山梨糖，20g·L^-1玉米浆，1g·L^-1 KH₂PO₄，0.2g·L^-1MgSO₄，and 12g·L^-1尿素，0.8～1.5mg·mL^-1的谷胱甘肽，余量为水；

②提取细胞内蛋白：

取步骤①获得的破碎细胞，每份100～200mg分别置于离心管中，每管加入0.5～2ml细胞裂解液，混匀，冰上间歇超声破碎20～50s；加入5～15μL的质量比为2～4∶1的DNase I/RNaseA酶混合溶液，混匀，4℃静置反应10～30min；加入5～15μL 80～120mM的苯甲基磺酰氟异丙醇溶液，4℃静置1～3h；15000rpm离心25～40min；取上清，得到蛋白溶液；所述细胞裂解液为：8mol·L^-1尿素，质量浓度为4％的(3-[(3-胆酰胺丙基)-二乙胺]-丙磺酸)，40mM的Tris，余量为水；

③蛋白浓度测定：

采用Bradford试剂盒，将牛血清蛋白由低浓度到高浓度加入考马斯亮蓝G-250溶液中，测定步骤②获得的各个蛋白溶液在595nm处的吸光值，建立标准曲线；测定各个蛋白溶液蛋白的浓度；

④沉淀蛋白

分别取包含50～150μg蛋白的步骤③获得的各个蛋白溶液，加入4～6倍体积的-20℃～-40℃的丙酮，沉淀12～20h；离心，弃上清，沉淀用-20℃～-40℃的体积浓度为70％-85％的丙酮水溶液洗涤；冷冻干燥备用；-80℃贮存；

⑤蛋白还原以及酶解

向步骤④所得的各个干燥蛋白中，添加10～40μL 40～60mM的三乙基碳酸氢铵水溶液溶解蛋白；

加入1～4μL三(2-羧乙基)膦，在50～60℃反应1h，对各个蛋白进行还原化处理；然后加入1～2μL甲基硫代磺酸甲酯，室温反应10～15min，终止还原反应；

向上述溶液中，加浓度为0.2～0.3μg/μL的胰蛋白酶水溶液20～30μL，37℃反应12～18小时，进行蛋白酶解；

⑥蛋白标记

在每个经步骤⑤酶解的蛋白酶解液中分别加入一管用60～80μL乙醇溶解的iTRAQ标记试剂，室温反应1h；

⑦溶液混合

将步骤溶液⑥获得的溶液混合得3-5份混合液，使每个混合液中都包括从培养基A中发酵1h收集淬灭的破碎细胞再经步骤②-⑥后获得的标记蛋白、从培养基A中发酵15h收集淬灭的破碎细胞再经步骤②-⑥后获得的标记蛋白、从培养基B中发酵1h收集淬灭的破碎细胞再经步骤②-⑥后获得的标记蛋白和从培养基B中发酵15 h收集淬灭的破碎细胞再经步骤②-⑥后获得的标记蛋白；于-20℃保存；

⑧差异表达蛋白鉴定

将⑦中得到的混合液，进行Q-Tof质谱鉴定，得到蛋白谱，通过定量得到各混合组样品的差异表达蛋白；

(2)主成分分析：

采用matlab对步骤(1)⑧中得到的数据进行标准化后，进行主成分分析，得到具有不同变化规律的数据类别，获得候选差异蛋白；

(3)过程分析

将步骤(2)获得的候选差异蛋白含量按照时间序列制成图表，观察并分析这些蛋白变化的规律，进而发现谷胱甘肽在提高氧化葡糖杆菌产2-酮-L-古龙酸过程中的作用。