[发明专利]检测谷胱甘肽作用于氧化葡糖杆菌过程中细胞内蛋白质变化的方法

说明书

技术领域

本发明属于工业微生物领域，涉及一种检测谷胱甘肽促进氧化葡糖杆菌产2-酮-L-古龙酸过程中细胞内蛋白质变化的方法。

背景技术

蛋白质是构成细胞的重要组成部分，对蛋白质结构和功能的研究将直接阐明细胞在不同生长条件下的变化机制。一方面可以对其上游的基因组学信息进行验证，提供后续基因改造的依据，另一方面又可以对其下游的代谢物研究提供指导。蛋白组学的发展，主要依托高效的蛋白分离和鉴定技术，主要有二维凝胶电泳和液相色谱分离两种分离方法，其中，液相色谱分离然后经质谱鉴定蛋白质，具有高度自动化，高分辨率的优势，是目前蛋白组学发展的主流。基于液相色谱分离，Q-TOF鉴定蛋白技术的使用，可以从整体水平上检测细胞在发酵过程中各种结构蛋白以及功能蛋白的变化水平。

氧化葡糖杆菌被用于维生素C的工业发酵，此发酵是氧化葡糖杆菌与巨大芽孢杆菌共同作用完成的，然而氧化葡糖杆菌单独发酵，生长缓慢，产量较低。添加谷胱甘肽后，菌体生长及2-酮-L-古龙酸产量显著提高，其作用机理尚不明确，对以后对氧化葡糖杆菌进行分子改造尚不能提供有利信息。

发明内容

本发明的目的是通过高通量的蛋白组学的手段来了解添加谷胱甘肽进行氧化葡糖杆菌发酵过程中的蛋白质变化规律，进一步揭示谷胱甘肽促进氧化葡糖杆菌生长及2-酮-L-古龙酸生产的作用机制，为对氧化葡糖杆菌进行分子生物学改造提供有利信息，从而提高其生长及生产能力，提供一种检测谷胱甘肽提高氧化葡糖杆菌产2-酮-L-古龙酸过程中细胞内蛋白质变化的方法。

本发明的技术方案概述如下：

一种检测谷胱甘肽作用于氧化葡糖杆菌过程中细胞内蛋白质变化的方法，包括如下步骤：

(1) 细胞内蛋白质的测定：

①细胞收集及淬灭：

取3-5份氧化葡糖杆菌以8％～16％的体积比分别接种到发酵培养基A中，另取3-5份所述氧化葡糖杆菌以8％～16％的体积比分别接种到发酵培养基B中，将两种接种后的培养基在28℃～32℃，转速为200～250rpm的条件下培养发酵，在发酵过程中选取1h、15h为取样点取出发酵液样品，在4℃下，以4000～6000rpm的转速离心，收集下层的细胞，并用pH为7.2～7.4的磷酸盐缓冲液清洗，用液氮淬灭，终止代谢反应；用液氮研磨破碎细胞，获得3-5份从培养基A中发酵1h收集淬灭的破碎细胞，3-5份从培养基A中发酵15h收集淬灭的破碎细胞，3-5份从培养基B中发酵1h收集淬灭的破碎细胞，3-5份从培养基B中发酵15h收集淬灭的破碎细胞；

所述发酵培养基A为：80g·L^-1山梨糖，20g·L^-1玉米浆，1g·L^-1 KH₂PO₄，0.2g·L^-1MgSO₄，和12g·L^-1尿素，余量为水；

所述发酵培养基B为：80g·L^-1山梨糖，20g·L^-1玉米浆，1g·L^-1 KH₂PO₄，0.2g·L^-1MgSO₄，and 12g·L^-1尿素，0.8～1.5mg·mL^-1的谷胱甘肽，余量为水；

②提取细胞内蛋白：

取步骤①获得的破碎细胞，每份100～200mg分别置于离心管中，每管加入0.5～2ml细胞裂解液，混匀，冰上间歇超声破碎20～50s；加入5～15μL的质量比为2～4∶1的DNase I/RNaseA酶混合溶液，混匀，4℃静置反应10～30min；加入5～15μL 80～120mM的苯甲基磺酰氟异丙醇溶液，4℃静置1～3h；15000rpm离心25～40min；取上清，得到蛋白溶液；所述细胞裂解液为：8mol·L-1尿素，质量浓度为4％的(3-[(3-胆酰胺丙基)-二乙胺]-丙磺酸)，40mM的Tris，余量为水；

③蛋白浓度测定：

采用Bradford试剂盒，将牛血清蛋白由低浓度到高浓度加入考马斯亮蓝G-250溶液中，测定步骤②获得的各个蛋白溶液在595nm处的吸光值，建立标准曲线；测定各个蛋白溶液蛋白的浓度；

④沉淀蛋白