[发明专利]一种耐高温Pyrolobus聚合酶及其高效表达质粒和应用

权利要求书

1.一种耐高温Pyrolobus聚合酶，其特征在于：所述的Pyrolobus聚合酶为YP_004780419.1蛋白，在Pyrolobus聚合酶的碳端有用连接序列GGSG连接的Sso7d DNA结合蛋白；其中，Pyrolobus聚合酶的序列如序列表中的序列1所示；Sso7d DNA结合蛋白的序列如序列表中的序列3所示。

2.一种用于表达耐高温Pyrolobus聚合酶的DNA，其特征在于：片段包括在5’端的NdeI的限制性内切酶位点、Pyrolobus聚合酶编码序列、GGSG连接序列、Sso7d的编码序列和3’端的XhoI的限制性内切酶位点，DNA具体序列如序列表中的表2所示。

3.一种高效表达耐高温Pyrolobus聚合酶的质粒，其特征在于：质粒载体为pET28a，在其上克隆有权利要求2所述的用于表达耐高温Pyrolobus聚合酶的DNA。

4.一种构建权利要求3所述的高效表达耐高温Pyrolobus聚合酶的质粒方法，其特征在于，包括酶切反应、连接反应和质粒质量检测，其中，

酶切反应：50μL酶切反应体系包括：500ng Pyrolobus聚合酶的DNA或500ng pET28a载体，5μL反应缓冲液，0.5μL NdeI，0.5μL XhoI，补水至50μL；37℃，保温1h；反应结束后，过柱纯化；

连接反应：20μL连接反应体系包括：50ng酶切后pET28a，100ng酶切后Pyrolobus聚合酶的DNA，10μL快速连接酶反应缓冲液，1μL T4 DNA连接酶，加蒸馏水至20μL；25℃，保温5min，转至冰上冷却；

质粒质量检测为测序检测。

5.一种高效表达耐高温Pyrolobus聚合酶体系，其特征在于：表达菌株为T7表达菌株BL21 DE3，在其内转化有权利要求3所述的高效表达耐高温Pyrolobus聚合酶的质粒。

6.一种构建高效表达耐高温Pyrolobus聚合酶体系的方法，其特征在于：将权利要求3所述的高效表达耐高温Pyrolobus聚合酶的质粒转化入T7表达菌株BL21 DE3；具体步骤包括：感受态细胞冰上解冻细胞10min，加入1ng的检测正确的质粒DNA，混匀，置于冰上30min；

然后42℃热激30s，再置于冰上5min；

加入950μL室温的SOC培养基，37℃，250rpm振荡培养60min，取2μL加98μL培养基混匀细胞涂布于氨苄霉素的选择平板上，37℃过夜培养。

7.权利要求1所述的耐高温Pyrolobus聚合酶在PCR反应中的应用。