[发明专利]一种耐高温Pyrolobus聚合酶及其高效表达质粒和应用

说明书

技术领域

本发明属于基因重组技术领域，具体涉及一种耐高温Pyrolobus聚合酶及其高效表达质粒和应用。

背景技术

现有的耐热DNA聚合酶大多来源于嗜热菌。嗜热菌成为许多耐高温酶的主要来源，受到科学家的广泛关注。DNA聚合酶耐高温性对其在DNA扩增，DNA测序，DNA探针标记以及反转录等应用中必不可少的品质。在DNA扩增中应用广泛的聚合酶链式反应（PCR）是一个依赖于周期性的加热和冷却的循环过程。首先复制的双链DNA模板在高温（94℃~98℃）下变形成单链DNA，单链DNA在降温后和引物杂交，然后聚合酶在最适合温度下由引物合成一条和单链DNA配对的新DNA片段。每个循环DNA的总量就增加一倍。一般的PCR反应需要20~40个循环。催化此反应的聚合酶耐高温是催化的重要前提。现有的耐高温的有商业价值的聚合酶，例如Taq来源于嗜热菌（Thermus aquaticus），其最适合温度在75℃~80℃，在95℃下的半衰期有2h。但Taq的保真性和速度都不高。Pyrococcus 是一类在100℃下生长的嗜热古菌。从Pyrococcus中分离的聚合酶，有很好的保真性但较慢的速度。

Pyrolobus fumarii 是另一类超嗜热古菌。在1997年首次在大西洋中脊背的超热矿物质喷口处被发现，可以在高达113℃下繁殖。其基因组在2011年9月21号完成发布。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种耐高温Pyrolobus聚合酶，以使其较高的温度耐受性。本发明的另一目的是提供一种高效表达Pyrolobus聚合酶的质粒。本发明还有一目的是提供一种高效表达Pyrolobus聚合酶的体系。本发明还有一目的是提供一种构建高效表达Pyrolobus聚合酶的体系的方法。本发明还有一目的是提供一种构建高效表达Pyrolobus聚合酶的质粒的方法。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种耐高温Pyrolobus聚合酶，所述的Pyrolobus聚合酶为YP_004780419.1蛋白，在Pyrolobus聚合酶的碳端有用连接序列GGSG连接的Sso7d DNA结合蛋白；其中，Pyrolobus聚合酶的序列如序列表中的序列1所示；Sso7d DNA结合蛋白的序列如序列表中的序列3所示。

一种用于表达耐高温Pyrolobus聚合酶的DNA，片段包括在5’端的NdeI的限制性内切酶位点、Pyrolobus聚合酶编码序列、GGSG连接序列、Sso7d的编码序列和3’端的XhoI的限制性内切酶位点，DNA具体序列如序列表中的表2所示。

一种高效表达耐高温Pyrolobus聚合酶的质粒，质粒载体为pET28a，在其上克隆有上述的用于表达耐高温Pyrolobus聚合酶的DNA。

一种构建高效表达耐高温Pyrolobus聚合酶的质粒方法，包括酶切反应、连接反应和质粒质量检测，其中，

酶切反应：50μL酶切反应体系包括：500ng Pyrolobus聚合酶的DNA或500ng pET28a载体，5μL反应缓冲液，0.5μL NdeI，0.5μL XhoI，补水至50μL；37℃，保温1h；反应结束后，过柱纯化；

连接反应：20μL连接反应体系包括：50ng酶切后pET28a，100ng酶切后Pyrolobus聚合酶的DNA，10μL快速连接酶反应缓冲液，1μL T4 DNA连接酶，加蒸馏水至20μL；25℃，保温5min，转至冰上冷却；

质粒质量检测为测序检测。

一种高效表达耐高温Pyrolobus聚合酶体系，表达菌株为T7表达菌株BL21 DE3，在其内转化有权利要求3所述的高效表达耐高温Pyrolobus聚合酶的质粒。

一种构建高效表达耐高温Pyrolobus聚合酶体系的方法，将上述的高效表达耐高温Pyrolobus聚合酶的质粒转化入T7表达菌株BL21 DE3；具体包括：感受态细胞冰上解冻细胞10min，加入1ng的检测正确的质粒DNA，混匀，置于冰上30min。然后42℃热激30s，再置于冰上5min。加入950μL室温的SOC培养基，37℃，250rpm振荡培养60min，取2μL加98μL培养基混匀细胞涂布于氨苄霉素的选择平板上，37℃过夜培养。

上述的耐高温Pyrolobus聚合酶在PCR反应中的应用。