[发明专利]一株纤维素酶产生菌株P5的制备和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一株纤维素酶产生菌株P5的制备和应用，及其菌种鉴定的方法，所筛选到的细菌其分泌型纤维素酶具有适应温度范围广、耐一定酸碱性的特点。

背景技术

纤维素是自然界中分布广泛且产量最丰富的一种碳水化合物资源，但是由于降解困难，导致纤维素资源的利用率非常的低。比如秸秆和皮壳等原料大部分都被焚烧掉，这样做既危害生态平衡，又加重环境污染。纤维素分子可被纤维素酶降解。纤维素酶是一个酶系，能降解β-1，4-葡萄糖苷键。纤维素酶的研究是纤维素资源综合利用的基础。目前用于纤维素生物降解研究的微生物大多属于真菌,而在细菌中筛选开发高效纤维素降解菌和纤维素酶的研究相对要少很多。纤维素降解细菌的研究大多集中在芽胞杆菌类，在Pantoea ananatis中的研究未有报道。随着分子生物学、基因工程的迅猛发展,国内外均尝试应用基因工程技术来筛选、改造和构建高效纤维素降解菌株、开发新型高效的纤维素酶。因此，需要通过生物技术方法加大对细菌纤维素酶的研究，以开发出新型的纤维素酶。

发明内容

本发明的目的在于提供一株新型纤维素酶产生菌，以及通过16S rDNA对菌株鉴定的方法。所筛选到的纤维素酶产生菌株P5具有适应温度范围广、耐一定酸碱性的特点。能被应用于生物能源、洗衣纺织、食品加工、发酵生产等多个行业。

本发明的技术方案是：一株纤维素酶产生菌，所述菌株在中国普通微生物保藏管理中心的保藏号为：CGMCC NO.5356；保藏日期2011年10月17日，分类命名为Pantoea ananatis，菌株的 16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所述。该菌株的16S rDNA基因序列已登录Genbank数据库，登录号是FJ796221。

上述纤维素酶产生菌的制备方法为：

（1）从腐烂植物枝叶表面及附近的土壤中分离样品，样品加入50 mLLB培养基中，在250 mL锥形瓶中,以160 rpm转速于37°C培养24 h涂布于LB固体平板上，获得菌株;所述LB液体培养基组分为：每1L蒸馏水中含有蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g；所述LB固体平板组分为：每1L蒸馏水中含有蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g琼脂粉12g；

（2）将菌落接种到产纤维素酶菌株筛选培养基，于培养温箱中培养2-4 d，筛选纤维素酶的产生菌，所用的培养基为：每1L培养基中含有羧甲基纤维素钠10 g，蛋白胨10g，酵母粉5 g，KH₂PO₄ 1 g，MgSO₄ 0.2 g，NaCl 10 g，葡萄糖2 g，琼脂粉12 g，以蒸馏水补足体积至1L；

（3）将0. 5%的刚果红倒入接种培养后的产纤维素酶菌株筛选培养基中染色5 min，倒掉刚果红后，使用5%的NaCl溶液浸泡脱色1h，筛选获得产纤维素酶菌株。

（4）对菌株16S rDNA基因克隆和序列分析；用于克隆细菌16S rDNA基因的通用上游引物序列为：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG, 通用下游引物序列为：GGTTACCTTGTTA CGACTT。

本发明的有益效果是: 用含有羧甲基纤维素钠的产纤维素酶菌株筛选培养基和基因工程技术手段，从土壤中筛选并鉴定本发明的纤维素酶产生菌株P5，经菌株分泌型纤维素酶特性分析表明，该菌分泌的纤维素酶具有适应温度范围广、耐一定酸碱性的特点。本发明采用的筛选和鉴定方法易操作，结果准确性高。该菌及其分泌的纤维素酶将在生物能源、洗衣纺织、食品加工、发酵生产等多个行业中具有应用潜力。

附图说明

图1是纤维素酶产生菌株P5的基因组DNA和16S rDNA的琼脂糖凝胶电泳图（1：基因组DNA；2：Marker，从上到下一次大小为2000bp,1000bp,750bp, 500bp, 250bp,100bp；3：16S rDNA）。

图2是培养时间对菌株P5产纤维素酶的影响数据图。

图3是培养温度对菌株P5产纤维素酶的影响数据图。

图4是pH对菌株P5纤维素酶酶活的影响数据图。

图5是温度对菌株P5纤维素酶酶活的影响数据图。

具体实施方式

一、主要材料

（1）培养基

LB液体培养基组分为：每L培养基中含有蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g；