[发明专利]一种鸡传染性支气管炎病毒HA抗原的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种抗原的制备方法，具体涉及一种鸡传染性支气管炎病毒HA抗原的制备方法。属于生物工程领域，

背景技术

鸡传染性支气管炎(IB)是由鸡传染性支气管炎病毒(IBV)引起的一种急性高度接触性传染病。表现为咳嗽、喷嚏、气管罗音等症状。产蛋鸡产蛋下降，产畸形蛋，幼鸡表现特别严重。某些毒株引起肾脏和肠道疾病。鸡传染性支气管炎给世界养禽业带来了严重的经济损失。由于IBV具有高度的变异性，故其血清型众多，各种血清型间的交叉保护反应较低，疫苗免疫常常失去预期的效果。

多数IBV表面没有凝集原，对动物红细胞无自然血凝特性，病毒必须浓缩后经酶处理方能表现出血球凝集(HA)活性，并且这种HA活性能被特异性IBV抗血清所抑制。根据这一特性，国内外学者建立了检测IBV抗体血凝抑制(HI)试验的方法。该方法快速、简便、特异性强，目前已应用于IBV诊断及抗体检测。目前HA抗原液的制作方法大多仍是超速离心浓缩，采用磷脂酶C处理，灭活常用灭活剂来灭活，稳定剂加入壳聚糖等，原有这种方法主要存在的问题有：(1)由于磷脂酶C价格高，提高了HA抗原液的成本。(2)抗原液经灭活剂灭活后降低了抗原液的血凝价。(3)壳聚糖不溶于水。(4)超速离心抗原效价低。

发明内容

本发明的目的是为了解决上述生产实际中存在的问题，提供一种低成本、效价高且稳定、安全性好的鸡传染性支气管炎病毒HA稳定抗原的制备方法。

为了实现上述目的，本发明的一种鸡传染性支气管炎病毒HA抗原的制备方法是按下述步骤进行的：

(1)病毒增殖

将病毒株用无菌生理盐水按体积比1∶50倍稀释后，经尿囊腔接种11日龄SPF鸡胚，每胚0.1mL，置37℃继续孵育，弃去24h前死胚，36h后取出所有胚放入4℃冰箱过夜，收集尿囊液，4℃保存备用；

(2)病毒液浓缩与A型产气荚膜梭菌培养液处理

将收集的尿囊液以3000-5000rpm高速冷冻离心30min，取上清液以20000-25000rpm高速冷冻离心50-60min后，弃去上清液，沉淀用支气管尿囊液充分悬浮，支气管尿囊液的添加量是第一次离心后所取上清液体积的1/200-1/100，悬浮液用透析袋进行浓缩；然后按浓缩后液体体积的10％-50％加入产气荚膜梭菌培养液，充分混合后置37℃水浴作用2-3h，每隔20min震荡一次，作用完毕后取出病毒液置4℃保存备用；

(3)抗原的灭活

(4)抗原的稳定

按病毒液与稳定剂体积比3-10∶1的比例加入稳定剂，震荡混匀后利用冷冻干燥技术冻干后即得到鸡传染性支气管炎病毒HA抗原；

(5)使用鸡红细胞悬液进行抗原测定，并于4℃中判定。

在本发明的具体实施例中，本发明所用的病毒株为鸡肾型传染性支气管炎病毒M41株，购自中国兽药监察所。

在本发明的具体实施例中，所述的产气荚膜梭菌培养液按以下方法制备：将产气荚膜梭菌菌株以3％的接种量接种于厌气肉肝汤培养基后，放入37℃温箱中培养24小时。培养液以5000r/min离心30分，取上清液经0.22μm微孔滤器过滤后分装即得，-20℃保存。

在本发明的具体实施例中，所述的病毒经上述步骤(2)处理后4℃要放置7天。

在本发明的具体实施例中，所述的灭活是将病毒液置56℃水浴灭活30min。

在本发明的具体实施例中，所述的鸡红细胞悬液浓度为0.5％。

在本发明的具体实施例中，所述的稳定剂为N-2羟丙基三甲基氯化氨壳聚糖。

N-2羟丙基三甲基氯化氨壳聚糖可按现有常规方法制备，作为参考，在本发明的具体实施例中，N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖是按以下方法制备得到的：

(1)壳聚糖的脱乙酰化处理

将脱乙酰度为80％壳聚糖50g分散在质量分数为20％NaOH的溶液中，110℃，压力0.2Mpa条件下回流搅拌反应3h，倾去上清液，去离子水洗至中性。

(2)壳聚糖的浸泡处理

将2g脱乙酰处理的壳聚糖溶于体积分数为1％乙酸溶液中，搅拌溶解，真空抽滤，滤去不溶物。在500～1000r/min搅拌条件下逐滴加入0.1mol/L NaOH溶液，调节壳聚糖溶液pH≈9，逐渐有白色沉淀析出，浸泡8h，抽滤，去离子水洗至滤液呈中性，抽干水分；最后，向滤饼中加入15mL异丙醇，搅拌30min分散均匀，倒入三口烧瓶。

(3)壳聚糖与2，3-环氧丙基三甲基氯化铵开环反应