[发明专利]一种用于酯交换反应的凹凸棒土固定化酶的制备方法

权利要求书

1.一种用于酯交换反应的凹凸棒土固定化酶的制备方法，其特征在于它包括如下步骤：

1)凹凸棒土的酸处理：按凹凸棒土∶盐酸溶液＝1g∶10mL，选取凹凸棒土和盐酸溶液；其中盐酸溶液浓度为4-6mol/L；

将凹凸棒土浸泡于盐酸溶液中，浸泡时间10-20h，处理完毕后，用纯水洗至中性，得到酸处理后的凹凸棒土；

2)凹凸棒土的表面化学改性：将酸处理后的凹凸棒土悬浮于反应溶剂中，得到浓度为20-50mg/mL的悬浮液；

按硅烷化试剂总量∶反应溶剂＝30-50mmol∶1L，选取硅烷化试剂；其中，硅烷化试剂由硅烷偶联剂A和硅烷偶联剂B组成，硅烷偶联剂A与硅烷偶联剂B的摩尔比为1∶0.5-1∶2；

按催化剂的用量为反应溶剂体积的3％-6％，准备催化剂；

将硅烷化试剂和催化剂与上述悬浮液混合，得到混合物；混合物在40-60℃，氮气保护下机械搅拌反应10-20h，机械搅拌速度为200-400rpm；反应结束后，采用离心分离出颗粒状物，颗粒状物用蒸馏水和甲醇交替清洗3-5次后，得到清洗后的颗粒状物；将清洗后的颗粒状物真空干燥，得到化学改性的凹凸棒土颗粒；

3)脂肪酶在凹凸棒表面的固定化：按脂肪酶∶pH 5.0-7.0的磷酸盐缓冲溶液＝2-5mg∶1mL，将脂肪酶加入到20-100mmol、pH 5.0-7.0的磷酸盐缓冲溶液中进行酶的吸附固定，得到脂肪酶溶液；

按化学改性的凹凸棒土颗粒∶脂肪酶溶液＝50-80mg∶1mL，选取化学改性的凹凸棒土颗粒和脂肪酶溶液；将化学改性的凹凸棒土颗粒置于脂肪酶溶液中机械搅拌，进行脂肪酶的固定化，反应温度15-30℃，机械搅拌速度150-200rpm，反应时间2-6h，反应结束后，经蒸馏水清洗3-5次，用有机溶剂浸泡1-3h，离心分离后冷冻干燥，得到用于酯交换反应的凹凸棒土固定化酶。

2.根据权利要求1所述的一种用于酯交换反应的凹凸棒土固定化酶的制备方法，其特征在于：步骤1)所述的凹凸棒土的粒径为100-400目。

3.根据权利要求1所述的一种用于酯交换反应的凹凸棒土固定化酶的制备方法，其特征在于：步骤2)所述的反应溶剂为乙醇或异丙醇。

4.根据权利要求1所述的一种用于酯交换反应的凹凸棒土固定化酶的制备方法，其特征在于：步骤2)所述的硅烷偶联剂A为异丁基三甲氧基硅烷、异丁基三乙氧基硅烷、辛基三甲氧基硅烷或辛基三乙氧基硅烷；硅烷偶联剂B为巯丙基三甲氧基硅烷、巯丙基三乙氧基硅烷、氨丙基三甲氧基硅烷或氨丙基三乙氧基硅烷。

5.根据权利要求1所述的一种用于酯交换反应的凹凸棒土固定化酶的制备方法，其特征在于：步骤2)所述的催化剂为25-28％的浓氨水。

6.根据权利要求1所述的一种用于酯交换反应的凹凸棒土固定化酶的制备方法，其特征在于：步骤2)所述清洗后的颗粒状物需要采用氧化剂进行处理，按清洗后的颗粒状物∶氧化剂的配比＝20g-40g/100mL，选取清洗后的颗粒状物和氧化剂；将清洗后的颗粒状物置于氧化剂中，在30-40℃处理8-20h，然后用水清洗2-3次。

7.根据权利要求7所述的一种用于酯交换反应的凹凸棒土固定化酶的制备方法，其特征在于：所述的氧化剂为浓硝酸或浓度为30wt％-50wt％的双氧水。

8.根据权利要求1所述的一种用于酯交换反应的凹凸棒土固定化酶的制备方法，其特征在于：固定化酶吸附完成后浸泡所需的有机溶剂为丙酮或异丙醇。

9.根据权利要求1所述的一种用于酯交换反应的凹凸棒土固定化酶的制备方法，其特征在于：所述的脂肪酶，包括来源于动物的猪胰腺酶，或来源于微生物发酵的皱褶假丝酵母、解脂假丝酵母、南极假丝酵母、洋葱假单胞菌脂肪酶或米根霉。

10.根据权利要求1所述的一种用于酯交换反应的凹凸棒土固定化酶的制备方法，其特征在于：步骤3)中吸附固定温度为15-30℃，吸附固定时间为2-6h。