[发明专利]一种用于酯交换反应的凹凸棒土固定化酶的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于酯交换反应的凹凸棒土固定化酶的制备方法，具体涉及一种通过溶胶-凝胶法改性的凹凸棒土对酶进行吸附固定化方法，用于提高酶的固定化稳定性与催化活性，属催化材料与酶固定化技术领域。

背景技术

油脂酯交换反应是指油脂(包括各种天然的植物油、动物脂肪以及食品工业的废油)与低碳醇、脂肪酸或/和脂肪酸酯、植物甾醇等在催化剂作用下进行的化学反应，是油脂及脂肪酸衍生物改性的重要手段之一，可制备出一系列高附加值化工产品或者保健产品，如脂肪酸低碳烷基酯(生物柴油)、甾醇酯、蔗糖酯等。常用的酯交换催化剂主要有甲醇钠、乙醇钠等烷氧基碱金属化合物。这些化学催化剂易于工业化但容易腐蚀设备，且易产生副产物，还存在后处理复杂、易造成三废污染环境等严重缺点。酶催化合成法条件温和，避免了高温产生的副反应，且产物容易分离纯化，但是游离酶的稳定性和回收、重复使用问题仍制约着实际生产中的应用。

凹凸棒土是一种天然纳米层链状结构的含水富镁硅酸盐粘土矿物，在我国资源丰富。其表面和内部含有大量的硅羟基、镁羟基、铝羟基等羟基，易于进行表面改性。凹凸棒土结构内部含有大量的结构水、结晶水和吸附水。这一点对于作为酶载体，可为酶提供一定的水分，对保持酶完整的结构是非常具有优势的。另一方面，凹凸棒土作为一种无机矿物，不仅价廉易得，而且具备了一般无机载体均具有的优点即机械强度高、热稳定性好、抗有机溶剂、抗微生物腐蚀等。采用凹凸棒土作为固定化酶的载体报道尚不多见，专利200610039833.4公开了脂肪酶在凹凸棒土表面的吸附固定化，由于只采用了单一的物理吸附，脂肪酶在使用过程中容易逐渐脱落，造成固定化酶活性的下降。单良等采氨丙基硅烷改性的凹凸棒土结合戊二醛法对菠萝蛋白酶进行了固定化，但是传统的硅烷化修饰方法需要使用大量有毒的甲苯等有机溶剂，且反应温度较高，制备过程不够环保。此外，文献报道疏水载体有利于提高固定化脂肪酶酯交换的催化活性，然而纯粹的疏水材料(如辛基硅胶)在水溶液中无法浸润，在固定化过程中会出现操作困难以及酶固定化不均匀的现象。采用溶胶-凝胶的方法对凹凸棒土进行表面修饰，使其具有疏水和离子交换双重保留作用，既可以提高脂肪酶的吸附量和稳定性，又可以提高其转酯化的催化活性，目前此方面的研究还没有报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于酯交换反应的凹凸棒土固定化酶的制备方法，该凹凸棒土固定化酶具有成本低廉，催化活性高、反复使用性能好、制备过程环保的特点。

为实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：一种用于酯交换反应的凹凸棒土固定化酶的制备方法，其特征在于它包括如下步骤：

1)凹凸棒土的酸处理(凹凸棒土先经过酸处理，以除去金属杂质，活化表面羟基)：按凹凸棒土：盐酸溶液＝1g∶10mL，选取凹凸棒土和盐酸溶液；其中盐酸溶液浓度为4-6mol/L；

将凹凸棒土浸泡于盐酸溶液中，浸泡时间10-20h(浸泡温度25-50℃)，处理完毕后，用纯水洗至中性，得到酸处理后的凹凸棒土；

2)凹凸棒土的表面化学改性：将酸处理后的凹凸棒土悬浮于反应溶剂中，得到浓度为20-50mg/mL的悬浮液；

按硅烷化试剂总量：反应溶剂＝30-50mmol∶1L，选取硅烷化试剂；其中，硅烷化试剂由硅烷偶联剂A和硅烷偶联剂B组成，硅烷偶联剂A与硅烷偶联剂B的摩尔比为1∶0.5-1∶2；

按催化剂的用量为反应溶剂体积的3％-6％，准备催化剂；

将硅烷化试剂和催化剂与上述悬浮液混合，得到混合物；混合物在40-60℃，氮气保护下机械搅拌反应10-20h，机械搅拌速度为200-400rpm；反应结束后，采用离心分离出颗粒状物，颗粒状物用蒸馏水和甲醇交替清洗3-5次后(各清洗3-5次)，得到清洗后的颗粒状物(另外，还可采用浓硝酸或H₂O₂将巯基氧化为磺酸根)；将清洗后的颗粒状物真空干燥，得到化学改性的凹凸棒土颗粒；

3)脂肪酶在凹凸棒表面的固定化：按脂肪酶：pH 5.0-7.0的磷酸盐缓冲溶液＝2-5mg∶1mL，将脂肪酶加入到20-100mmol、pH 5.0-7.0的磷酸盐缓冲溶液中进行酶的吸附固定，离心取上清液，得到脂肪酶溶液；