[发明专利]基于腺相关病毒的山羊β-乳球蛋白基因打靶质粒的构建及其打靶方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体地说，是关于一种基于腺相关病毒的山羊β-乳球蛋白基因打靶质粒的构建及其打靶方法。

背景技术

按照人类的意愿对基因组进行定向靶向修饰一直是许多科学家的梦想。在内源的基因组上特异地删除或加入需要的序列，一方面可以构建各种动物模型，用于生物学基础研究和疾病机理研究，另一方面可以生产动物反应器，用于廉价生产人们需要而又很难从其他途径得到的生物组分。

传统的基因打靶定向修饰依赖于细胞内自然发生的同源染色体随机交换，然而，这种方法效率非常低，通常只有10^-7。因此，这种打靶方法只有在小鼠的胚胎干细胞(ES细胞)中得到应用，但无法应用于体细胞和其他物种的干细胞中。

腺相关病毒(AAV)属于细小病毒科的依赖性病毒属，是最小和最简单的动物病毒，也是一种具有极端寄生性的卫星病毒。AAV通常需要腺病毒、疱疹病毒等辅助病毒的帮助，才能在其生活周期的繁殖相进行自我复制。

1998年，Russell等报道了用AAV作载体进行基因打靶的一系列实验。包括AAV被用于修复人宫颈癌HeLa细胞中neo基因的复合突变，以及在HT-1080人骨肉瘤细胞和正常人成纤维细胞中介导单拷贝X连锁HPRT基因的突变，并获得了较高的打靶频率，在最适条件下整个成纤维细胞组的大约1％在HPRT基因位点发生了打靶。相比之下，采用转染或电穿孔方式获得的基因打靶频率范围在10^-6到10^-8之间。并且，在许多打靶中，AAV介导的基因表达可以维持终身，充分说明了该载体的持续性。AAV载体打靶的高效率和持续稳定的目的基因表达对基因打靶技术的发展起了很大的推动，对科研甚至临床应用都有一定价值。

发明内容

本发明的首要目的是提供一种基于腺相关病毒为载体构建的山羊β-乳球蛋白基因打靶质粒及其构建方法。

本发明的另一个目的是提供上述山羊β-乳球蛋白基因打靶质粒的打靶方法。

本发明提供了一种基于腺相关病毒为载体的山羊β-乳球蛋白基因打靶质粒，所述质粒具有如下的序列：5’AAV，左臂，人乳铁蛋白cDNA，loxp-ef1a-neo-pA-loxp，核糖体插入序列(IRES)，右臂3’。

根据本发明，所述质粒的载体是将pAAV-MCS质粒的反向重复序列旁的Not I位点通过PCR的方法更改为BamH I位点获得。

根据本发明，所述质粒除载体外的插入片段的基因顺序为：5’左臂，人乳铁蛋白cDNA，loxp-ef1a-neo-pA-loxp，核糖体插入序列(IRES)，右臂3’。

根据本发明，所述左臂的序列为山羊基因组中β-乳球蛋白基因从翻译起始密码子ATG到上游366bp之间的序列。

根据本发明，所述右臂的序列为山羊基因组中β-乳球蛋白基因从翻译起始密码子ATG到下游380bp之间的序列。

根据本发明，所述插入片段具有如SEQ ID NO：1所示的序列。

本发明的基于腺相关病毒构建的山羊β-乳球蛋白基因打靶质粒的打靶方法，包括以下步骤：

A、将上述质粒与pAAV-RC，pHelper共同转染AAV-293细胞以包装病毒；

B、用上述获得的病毒感染山羊细胞24小时；

C、加G418筛选感染成功的细胞。

附图说明

图1是本发明的山羊β-乳球蛋白基因打靶质粒的线性示意图。

图2是本发明的山羊β-乳球蛋白基因打靶质粒的构建示意图。

图3是pAAV-MCS质粒示意图。

图4是包装AAV-mcherry病毒的AAV-293细胞的红色荧光结果图。

图5A是AAV-mcherry病毒滴度测定的HT1080细胞的红色荧光结果图。

图5B是AAV-mcherry病毒滴度测定的HT 1080细胞经DAPI染色的紫外检测结果图。

图6A是G418筛选感染打靶病毒的山羊iPS克隆结果图。

图6B是G418筛选未感染打靶病毒的山羊iPS克隆结果图。

具体实施方式

以下通过具体实施例对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明，而不用于限定本发明的范围。