[发明专利]建鲤促性腺激素释放激素基因六聚体原核表达载体及其构建方法和应用

权利要求书

1.建鲤促性腺激素释放激素基因六聚体原核表达载体，其特征在于所述的原核表达载体由表达载体pMAL-c2x构建而得，该载体含有T7启动子和终止子、细菌核糖体结合位点PBS、6个串联多聚体GnRH基因序列与一个GAP基因序列、及一个麦芽糖结合蛋白标签序列。

2.如权利要求1所述的建鲤促性腺激素释放激素基因六聚体原核表达载体，其特征在于所述6个串联多聚体GnRH基因的上游依次连接有麦芽糖结合蛋白标签序列、起始密码子、T7启动子ATG、细菌核糖体结合位点RBS、T7启动子；6个串联多聚体GnRH基因的下游依次连接有GAP基因序列、可被IPTG诱导的操作子序列、终止子。

3.如权利要求1所述的建鲤促性腺激素释放激素基因六聚体原核表达载体的构建方法，其特征在于由下述方法构建而得：

(1)从GeneBank中查找建鲤GnRH的全长基因序列，并采用Primer5.0设计了一对特异性引物:

上游引物1: 5′-ACTGAGGGAAACTTGGACTGAT-3′

下游引物引物2: 5'-CAAGGCAGAAATAGAAAGGAAG-3′

以提取自建鲤的丘脑总RNA为模板，进行反转录合成第一链cDNA,以反转录产物为模板及上述的上下游引物进行PCR扩增,反应条件为:94℃预变性3min, 94℃预变性30s, 55℃退火45s,72℃延伸1min, 30个循环, 72℃延伸7min；

(2)　PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定后用凝胶回收试剂盒回收,将回收产物与pMD18-T载体，16℃连接过夜,连接产物转化大肠杆菌JM109,随机挑取细菌,提取质粒后用EcoRⅠ、HindⅢ双酶切初步鉴定后,将阳性克隆进行DNA测序，测序结果用生物软件DNAstar、CLUSTAL X等进行分析；

(3)合成六聚体GnRH基因并与GAP基因相连接，并在其两端加上EcoRⅠ、HindⅢ 酶切位点，将其和原核表达质粒pMAL-C2X分别用EcoRⅠ、HindⅢ 37℃双酶切,用凝胶回收试剂盒回收GnRH/GAP片段和线性化pMAL质粒,按照T4 DNA连接酶的说明书设计连接反应体系,构建表达质粒pMAL-GnRH/GAP,并转化大肠杆菌JM109,筛选阳性克隆,随机挑取1-2个克隆进行酶切鉴定，获得建鲤促性腺激素释放激素基因六聚体原核表达载体pMAL-GnRH/GAP。

4.建鲤促性腺激素释放激素基因六聚体原核表达载体在制备重组GnRH蛋白中的应用。

5.建鲤促性腺激素释放激素基因六聚体原核表达载体在制备GnRH抗体的抗原中的应用。

6.根据权利要求4建鲤促性腺激素释放激素基因六聚体原核表达载体制备GnRH重组蛋白的方法，将pMAL-GnRH/GAP转化大肠杆菌TB1,挑取阳性克隆接种含50μg/mL的氨苄青霉素的LB液体培养基中, 37℃摇振培养过夜,取培养菌液以1/10的比例接种于新鲜的LB液体培养基(含氨苄青霉素)中,分别以0.5、1mol/L浓度的IPTG诱导, 37℃摇振培养4h后,收集菌体,加入溶菌酶至终浓度为1mg/mL,冰浴30min；最后加入DNA酶和RNA酶至终浓度为5μg/mL, 4℃孵育10 min，9000g离心30 min,将上清转移备用,上清即为表达的融合蛋白；将上清蛋白质上样于平衡缓冲液平衡好的Amylose-sepharose亲和柱中其中所述平衡缓冲液为20mmol/LTris-HCL, 200mmol/LNaCl, 1mmol/LEDTA, pH7·4,用缓冲液平衡至基线后,开始用洗脱缓冲液，所述的洗脱缓冲液为平衡缓冲液+10mmol/L麦芽糖中洗脱,洗脱液中即为纯化后的融合蛋白,最后SDS-PAGE电泳检测；在纯化好的蛋白中加入Factor Xa至终浓度为200μg/mL,室温作用4h,同上过Amylose- sepharose亲和柱,用平衡缓冲液洗脱下的即为GnRH重组蛋白。