[发明专利]建鲤促性腺激素释放激素基因六聚体原核表达载体及其构建方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于微生物基因工程领域，具体涉及一种高效表达建鲤促性腺激素(GnRH)的原核表达载体及其在GnRH蛋白的原核表达和制备抗GnRH多克隆抗体中的应用。

 

背景技术

促性腺激素释放激素(Gonadotropin-releasing hormone, GnRH)前体蛋白由信号肽、GnRH十肽(decapeptide)、促性腺激素释放激素相关肽(GnRHassociated peptide, GAP)构成,经酶切加工后释放出有活性的GnRH十肽。GnRH在调节脊椎动物的生殖发育中起着非常重要的作用,是下丘脑-垂体性腺(hypothalamic-pituitary-gonadal, HPG)轴的关键信息分子,通过刺激垂体前叶释放促性腺激素(Gonadotropin, GtH),在脊椎动物的性腺发育、繁殖功能的维持中起着重要的作用。关于GnRH的免疫原理,目前还没有确切说法。Meloen和Ook等文章中有所论述,认为是血液中的GnRH抗体特异性地中和了动物体内的GnRH,导致体内GnRH生物活性部分或完全丧失,引起内分泌系统平衡的改变,从而改变了HPG轴系,减少或杜绝精子(或卵子)的生成与成熟及激素的合成与释放。临床上用免疫接种技术控制GnRH的释放量来控制哺乳动物的性腺发育已经取得了成功,并表现出诱人的前景。Andersen与Riley等研究了抗虹鳟GnRH的免疫接种,提出了一种有望控制鱼类性成熟的方法,认为免疫抑制技术在控制虹鳟生殖方面有一定的应用潜力。

建鲤(Cyprinus carpiovar Jian)是鲤亚科鲤属的一种。为长体型，比野鲤背高、体宽，但比常见的杂交鲤体长, 具有生长速度快、适合多种养殖方式饲养、抗病力强等优点。建鲤是以特定的荷包红鲤和沅江鲤为亲本, 经6 代定向自繁自育而形成的良种，因此对性腺发育具有调节作用的GnRH研究具有一定的生产意义。人源GnRH已经通过基因工程手段获得了体外表达并在动物实验中获得了较好的免疫原性。高效表达GnRH基因的重组载体的制备可以高效获取重组蛋白可以满足其在鱼类人工繁殖中的运用，同时制备的抗体在现有研究中还未见有报道。

 

发明内容：

本发明的目的是提供一种GnRH六聚体的原核表达载体pMAL-GnRH，该载体含有T7启动子和终止子、细菌核糖体结合位点RBS和六聚体GnRH基因、GAP基因及一个麦芽糖结合蛋白标签，利用该载体转化大肠杆菌，可实现GnRH蛋白的高水平表达，表达的重组蛋白质以可溶性形式存在于上清中(占大肠杆菌可溶性总蛋白45.2%%)，通过亲和层析纯化很容易获得高纯度的重组蛋白质，用于蛋白质的制备。纯化GnRH蛋白的操作相当简单，成本也不高，极易重复使用。

为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：

建鲤促性腺激素释放激素基因六聚体原核表达载体，其特征在于所述的原核表达载体由表达载体pMAL-c2x构建而得，该载体含有T7启动子和终止子、细菌核糖体结合位点PBS、6个串联多聚体GnRH基因序列与一个GAP基因序列、及一个麦芽糖结合蛋白标签序列。

进一步说明所述的建鲤促性腺激素释放激素基因六聚体原核表达载体，其特征在于所述6个串联多聚体GnRH基因的上游依次连接有麦芽糖结合蛋白标签序列、起始密码子、T7启动子ATG、细菌核糖体结合位点RBS、T7启动子；6个串联多聚体GnRH基因的下游依次连接有GAP基因序列、可被IPTG诱导的操作子序列、终止子。

所述的建鲤促性腺激素释放激素基因六聚体原核表达载体的构建方法，其特征在于由下述方法构建而得：

(1)从GeneBank中查找建鲤GnRH的全长基因序列，并采用Primer5.0设计了一对特异性引物:

上游引物1:  5'-ACTGAGGGAAACTTGGACTGAT-3′

下游引物2:  5'-CAAGGCAGAAATAGAAAGGAAG-3′

反转录随机引物AP；

以提取自建鲤的丘脑总RNA为模板，进行反转录合成第一链cDNA,以反转录产物为模板及上述的上下游引物进行PCR扩增,反应条件为:94℃预变性3min, 94℃预变性30s, 55℃退火45s,72℃延伸1min, 30个循环, 72℃延伸7min；