[发明专利]一种检测转基因植物成分的重组质粒及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及包含酶或微生物的测定或检验方法，具体涉及包括叶绿体RBCL(ribulose，1.5-bisphosphate carboxylose large subunit，核酮糖1，5-二磷酸羧化酶大亚基)基因的重组质粒。

背景技术

随着转基因生物(GMO)的迅速发展，其安全性在全球范围内引起激烈的争论与普遍关注。为保障消费者的知情权和选择权，世界上许多国家和地区都制定了相应的法律和法规，加强对进出口转基因植物及其产品的管理，这给为转基因生物安全监管提供技术支撑的转基因检测工作带来更大的挑战。基于核酸的转基因检测技术是转基因检测的重要方法。目前转基因产品的核酸检测方法主要有核酸分子杂交技术(southern blot)、PCR检测技术和基因芯片技术。无论是哪种核酸检测方法都必须以一种准确、可靠、稳定的标准物质作为阳性对照，以防止假阴性的出现。传统的标准物质是以转基因材料与其对应的非转基因材料按一定的质量比例配制而成，目前主要依靠从国外购买，不仅价格高，还很不方便，严重影响日常转基因检测工作及检测技术研究的开展，因此亟需研制新型阳性对照材料。

质粒标准分子是一种含有转基因检测目的外源基因和内标准基因的特异性片段的重组质粒分子。与传统的阳性标准物质相比，质粒标准分子具有以下几方面的优点：(1)可以通过微生物进行大量培养无限获得，提取简便，且纯度较高，用量少；(2)可长期保存，稳定性好，使检测结果的准确性得到很大的提高；(3)同一个标准分子可以同时包含多个外源目的基因，经济又高效，是GMO鉴定检测中是很好的标准阳性物质替代物。因此构建阳性标准分子已经成为国际上转基因检测领域的研究热点。

目前国际上所构建的转基因成分标准质粒分子都是将1个品种或品系的内源参照基因和目的基因同时克隆到1个质粒中，在做不同物种、不同品系转基因成分检测时，需要多个标准分子，比较繁琐。现有的转基因产品主要含转基因植物成分。云南植物研究2002，24(3)：334-340发表了题为《植物转基因成分PCR检测内对照系统的建立》(作者：权洁霞等)一文，该文通过对23种植物的研究结果证实了植物叶绿体RBCL基因可作为内源参照基因用于转基因植物及其产品的检测。现有商业化的转基因产品中绝大多数都含有CaMV35S启动子或/和NOS终止子，目前也有针对CaMV35S启动子和NOS终止子检测转基因植物及其产品的相关报导，但CaMV35S启动子和NOS终止子的检测主要用于已知产品配料和转基因背景的产品检测，对于未知产品配料和转基因背景的产品(尤其是加工产品)，则由于缺乏通用的标准品或质粒标准分子而无法进行准确的判断。因此制备一种通用的检测转基因成分的质粒标准分子具有非常重要的意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种检测转基因植物成分的重组质粒，使用重组质粒可对转基因植物及其产品进行多靶点定性检测，具有方便快捷的优点。

本发明解决上述问题的技术方案是：

一种检测转基因植物成分的重组质粒，该质粒包括载体和基因片段，其特征在于，所述的基因片段由叶绿体RBCL基因的特异性序列、CaMV35S启动子的特异性序列和NOS终止子的特异性序列融合构成，其中，

所述的叶绿体RBCL基因的特异性序列如SEQ ID NO.1所示；

所述的CaMV35S启动子的特异性序列如SEQ ID NO.2所示；

所述的NOS终止子的特异性序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明所述的重组质粒，其中所述的载体可以是常用的pMD-T系列载体，如，pMDl8-T或pMD19-T。

本发明所述的重组质粒，其中所述的基因片段的融合方法为常用重组DNA分子的方法，如，酶切连接法和接头连接法。由于酶切连接法存在寻找酶切位点困难以及多个目的片段的连接需要进行多次的酶切、连接，不仅操作繁琐，而且连接效率较低，因此采用接头连接法较为理想。针对本发明所述的基因片段，本发明人所推荐的连接顺序依次是RBCL、CaMV35S和NOS，其中，RBCL与CaMV35S之间的接头的序列如SEQ ID NO.4所示，CaMV35S与NOS之间的接头的序列如SEQ ID NO.5所示。

上述SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.5所示序列的DNA片段可委托专业公司合成，也可从相关的植物产品中提取。为了节约资源，本发明人推荐以转基因大豆GTS40-3-2为原料，并设计出特定的引物即可制备出含SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.3所示序列的重组基因片段，具体制备方法如下所述。