[发明专利]一种基于免疫磁珠的CEA时间分辨荧光免疫分析试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于生物分析化学、纳米生物技术领域，具体地说，涉及一种基于免疫磁珠的CEA时间分辨荧光免疫分析试剂盒。

背景技术

癌胚抗原(CEA)是1965年Gold和Freedman首先从胎儿及结肠癌组织中发现的。CEA的编码基因位于19号染色体，是一种分子量为22000的多糖蛋白复合物，45%为蛋白质。一般情况下，CEA是由胎儿胃肠道上皮组织、胰和肝细胞所合成。通常在妊娠前6个月内CEA含量增高，出生后血清中含量已很低。正常情况下，CEA经胃肠道代谢，而肿瘤状态时的CEA则进入血液和淋巴循环，引起血清CEA异常增高。目前认为，CEA广泛存在于内胚叶起源的消化系统癌中，如胃癌、大肠癌、肝癌、胰腺癌，也可存在于小细胞肺癌、乳腺癌、甲状腺髓样癌中。因此，检测血清中CEA含量对上述癌症的诊断具有辅助价值。

目前常规的癌胚抗原检测大多采用酶免疫分析（Enzymatic immunoassay，EIA）、化学发光免疫分析（Chemilinescent immunoassay，CLIA）和时间分辨荧光免疫分析（Time-resolved fluoroimmunoassay，TRFIA）等。

酶联免疫法试剂盒为定性或半定量试剂，不能为临床医生提供精确的定量，很难有效指导临床的治疗。

CLIA与其它标记技术相比有许多优点：①无放射性辐射的危害；②灵敏度高，检测线性范围宽；③稳定性好、自动化程度高；④应用范围宽，可检测不同分子大小的抗原、半抗原和抗体，又可以用于核酸探针的检测。缺点是发光过程短、样品不能重复检测、本底较高及易受环境物质干扰。目前国内使用大部分为Roche、Abbott、Beckman为代表的进口试剂。

TRFIA技术是继放射免疫分析之后标记物发展的一个新里程碑，已成为生物医学研究和临床超微量生化检验中一项最有发展前景的分析手段。TRFIA以稀土离子作为标记物，具有制备简便、储存时间长、无放射性污染、标准曲线范围宽、不受样品自然荧光干扰和应用范围十分广泛等优点。然而，目前国内外厂家均采用基于微孔板TRFIA技术，由于微孔板的固液相反应面积小，需要的免疫反应时间较久；微孔板包被抗体或抗原是通过物理吸附包被，包被抗体或抗原很难标准化，使得检测结果精密度较差；微孔板TRFIA技术主要为半自动检测，或前处理加上TRFIA检测仪的准全自动检测，使得样本需要积累到一定量后才能检测。

免疫磁珠是免疫学和磁载体技术相结合而发展起来的一类新型材料，是一种磁珠表面包被特异性配基，可与抗体/抗原特异性的结合形成磁珠-抗体/抗原复合物，然后通过外加磁场的作用，使磁珠和溶液快速分离，磁珠与传统的微孔板相比具有以下的特点：                                                表面积更大，能结合更多的蛋白分子；可以通过共价键与探针分子连接，比聚苯乙烯为材料的微孔板的物理吸附作用更牢固；是一种小型的、流动的固相载体，使反应能更快的达到动态平衡，从而加快反应速度；表面结合的密度高，使荧光信号更集中；可以和不同的探针分子结合，使检测同一样本中不同的待测物成为可能；磁珠的外观和包被过程的灵活性更大，可以根据不同的实验要求进行选择。

磁珠的上述特点与时间分辨荧光免疫分析结合后可以减少反应所需的样本量，加快反应时间，易自动化，实验样本随到随做功能。

目前免疫磁珠在化学发光免疫分析、核酸提取等领域已有广泛的应用，但免疫磁珠结合时间分辨荧光免疫分析检测一些肿瘤相关抗原尚无文献报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于免疫磁珠的CEA时间分辨荧光免疫分析试剂盒。

本发明检测方法的基础是双抗体夹心的免疫反应：通过磁珠与抗体连接形成复合物，即免疫磁珠，用免疫磁珠、铕标记抗体及样本中CEA抗原在反应管中经过震荡孵育后形成免疫磁珠-CEA抗原-铕标抗体复合物。加入增强液震荡反应后，在紫外光的激发下发射出很强的荧光，用时间分辨仪器测定其荧光强度。荧光强度与样品中的CEA浓度成正比，对照标准曲线即可确定样品中抗原的量。

本发明的基于免疫磁珠的CEA时间分辨荧光免疫分析试剂盒包括：

1)    校准品

2)    连接抗CEA抗体的磁珠

3)    铕标记抗CEA抗体

4)    分析缓冲液

5)    洗涤液（25x）

6)    增强液

上述连接抗CEA抗体的磁珠的制备步骤为：磁珠活化→与抗CEA单克隆抗