[发明专利]单核细胞增生性李斯特菌与胎儿弯杆菌的检测试剂及应用

权利要求书

1. 一种单核细胞增生性李斯特菌与胎儿弯杆菌的检测试剂，其特征在于包含能扩增单核细胞增生性李斯特菌InlJ基因和胎儿弯杆菌16S rDNA基因的2对特异性引物， 其中P1和P2引物扩增InlJ基因片段，扩增长度为320 bp；P3和P4引物扩增胎儿弯杆菌16S rDNA基因片段，扩增长度为763 bp；所述引物序列为：

P1：<210>1；

P2：<210>2；

P3：<210>3；

P4:  <210>4。

2.一种单核细胞增生性李斯特菌与胎儿弯杆菌检测试剂的制备方法，其特征在于主要包括以下步骤：

（1）、单核细胞增生李斯特菌InlJ基因和胎儿弯杆菌16S rDNA基因保守序列的选择：从DNA序列数据库中下载已经公布的单核细胞增生李斯特菌InlJ基因和胎儿弯杆菌16S rDNA基因序列，分别用基因序列分析软件进行序列比对，选择两个基因高度保守的靶序列，其中单核细胞增生李斯特菌InlJ基因扩增的靶序列为：<210>5；胎儿弯杆菌16S rDNA基因扩增的靶序列为：<210>6；

（2）、特异性引物的设计及合成：

根据选择的单核细胞增生李斯特菌InlJ基因和胎儿弯杆菌16S rDNA基因的靶序列，用PCR引物设计软件分别进行引物的设计，将设计的引物进行最佳配对筛选试验，得到2对最佳引物：P1、P2及P3、P4，用全自动DNA合成仪进行引物的合成，其中P1和P2引物扩增InlJ基因片段，扩增长度为320 bp,P3和P4引物扩增胎儿弯杆菌16S rDNA基因片段，扩增长度为763 bp，所述引物序列为：

P1：<210>1；

P2：<210>2；

P3：<210>3；

P4: <210>4。

3.一种单核细胞增生性李斯特菌的检测试剂的应用方法，其特征在于主要包括以下步骤：

（1）、样品的处理：

取一定量的流产胎儿或胎盘病料，先用剪刀将其剪碎，再研磨至糊状，灭菌，倒入Eppendorf管中，置于冰上待用；

（2）、病料样品DNA的提取；

（3）、二联PCR反应：

采用50 μL PCR反应体系，PCR反应体系的组成为：10×PCR缓冲液5μL，25mmol/L MgCl₂ 5μL，2.5mmol/L dNTP 4μL，P1、P2 、P3、和P4（25pmol/μL）各1μL，病料样品中提取的DNA 2 ～6 μL，Taq DNA聚合酶（5U/μL）0.3μL，补加去离子水至50 μL；最佳循环参数均为96℃，150 s；94℃，40 s；72℃，80 s；52℃，50 s，最后72℃延伸10min；

（4）、 结果判定：

取二联PCR产物在琼脂糖凝胶上，电泳后并用溴化乙锭染色，然后在紫外光透射仪下观察拍照，以标准DNA marker （D,L-2000）作参考，若电泳后，若琼脂糖凝胶中同时出现2条核酸带，其中一条片段大小为320 bp，另一条片段大小为763 bp，说明病料样品中同时含有单核细胞增生李斯特菌和胎儿弯杆菌；如果仅出现320 bp大小的核酸片段，则表明病料样品中含有单核细胞增生李斯特菌；如果仅出现763 bp大小的核酸片段，则表明病料样品中含有胎儿弯杆菌；若不出现任何核酸片段，则表明病料样品中不含有单核细胞增生李斯特菌和胎儿弯杆菌。

4.如权利要求3所述的单核细胞增生性李斯特菌的检测试剂的应用方法，其特征在于步骤（1）中样品的处理主要过程如下：取一定量的流产胎儿或胎盘病料，先用剪刀将其剪碎，再用试管式研磨器用力研磨至糊状，加适量的灭菌的PBS，倒入1.5mL的Eppendorf管中，置于冰上待用。