[发明专利]单核细胞增生性李斯特菌与胎儿弯杆菌的检测试剂及应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种能够鉴别单核细胞增生李斯特菌与胎儿弯杆菌性流产的分子检测技术，特别是提供了能够用于鉴别单核细胞增生性李斯特菌与胎儿弯杆菌性流产的分子检测试剂及其制备方法和应用，属于动物性食品病原学检测技术领域。 

背景技术

怀孕母畜流产是兽医临床中最常见的疾病。在畜牧业生产实践中，引起母牛母羊流产的诱因很多，主要有遗传、气候与环境、内分泌、微生物和饲养管理等因素，其中由病原微生物引起的流产是重要的诱因。单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，LM）是一种能引起人和动物李斯特菌病的人兽共患病原菌。自从1926年首次分离到该菌以来，目前已证实该菌可感染绵羊、山羊、牛、猪、鹿、鸡、兔、鼠、鸭、鹅、鹦鹉、北极狐等40多种动物。在家畜上，LM可引起脑膜脑炎、流产和急性败血病；在家禽上，LM可导致败血症和心肌坏死的发生，每年该病都对我国畜禽养殖业造成较大的经济损失。同时，作为一种重要的食源性细菌，该菌能污染肉、奶、蛋等动物性食品而引起食品中毒，并能导致孕妇、新生儿及免疫力低下的成年人发病，对人类的健康也构成极大的威胁，被列为是四大食源性病原菌之一。胎儿弯杆菌(Campylobacter fetus)是引起牛羊流产的重要病原之一。该菌属于弯杆菌属的成员，包括胎儿弯杆菌胎儿亚种(C. fetus subsp. fetus)和胎儿弯杆菌性病亚种(C. fetus subsp.venerealis)。胎儿弯杆菌可感染人，尤其患有免疫缺陷症的人，感染后能引起脑膜炎、菌血症、关节炎、腹泻等疾病。因此，胎儿弯杆菌严重威胁着人类的健康并给畜牧业造成重大经济损失。

近年来，由单核细胞增生李斯特菌和胎儿弯杆菌感染导致的牛羊流产病例日益增多，在畜牧业生产上根据临床症状无法鉴别上述两种细菌感染引起的流产。目前，国内对于单核细胞增生李斯特菌和胎儿弯杆菌病的诊断方法主要依赖于病原的分离、生化实验等常规方法，但由于胎儿弯杆菌的生长需要严格的气体环境和生化条件，而且对采集的病料有特殊要求，一般的实验室不具培养条件，特别是胎儿弯杆菌在合适的培养基上也生长缓慢，得到了可疑菌落，用生化试验来鉴定胎儿弯杆菌难度仍然较大。这给胎儿弯杆菌的分离带来很大困难；单核细胞增生李斯特菌培养法虽然准确，但制备培养基、计算菌落数量和鉴定菌落的生化特性都耗时耗力，并且培养方法的成功依赖于样本中细菌的数量和状况和培养基选择，不适合当前快速检测的需求。对单核细胞增生李斯特菌和胎儿弯杆菌免疫学方法包括酶联免疫吸附试验（ELISA）和酶联荧光分析法（ELFA）。ELISA法虽然敏感性较高，但其缺点当检测样品受污染时特异性较差；ELFA法虽然特异性和敏感性都较高，但该方法的缺点是成本较高。

鉴于单核细胞增生李斯特菌和胎儿弯杆菌常规检测方法存在一定的不足，目前迫切需要研究能快速鉴别单核细胞增生李斯特菌与胎儿弯杆菌性流产的分子检测试剂和方法。近年来，随着分子细菌学的快速发展，检测单核细胞增生李斯特菌和胎儿弯杆菌的分子生物学技术也逐渐建立起来。与常规细菌培养法和免疫学方法相比，分子生物学技术在检测单核细胞增生李斯特菌方面具有快速、特异、敏感和准确等优势。内化素J（InlJ）基因是存在于单核细胞增生李斯特菌基因组中的保守基因，而16S rDNA基因在胎儿弯杆菌基因组中也高度保守。因此，根据两种细菌的保守基因可以设计和合成针对两种细菌的特异性的分子检测试剂，用于检测并鉴别上述两种细菌引起的牛羊流产。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用单核细胞增生李斯特菌InlJ基因和胎儿弯杆菌16S rDNA基因高度保守序列设计合成了2对用于鉴别上述两种细菌的分子检测试剂。

本发明的另一目的是提供一种简单实用、易操作的上述检测试剂的制备方法。

本发明的再一目的是提供一种快速、特异性强、敏感性高、重复性好，应用上述分子检测试剂建立的检测单核细胞增生李斯特菌和胎儿弯杆菌并能鉴别两菌的二联PCR检测应用方法。

本发明公开了一种单核细胞增生性李斯特菌与胎儿弯杆菌的检测试剂，其特征在于包含能扩增单核细胞增生性李斯特菌InlJ基因和胎儿弯杆菌16S rDNA基因的2对特异性引物， 其中P1和P2引物扩增InlJ基因片段，扩增长度为320 bp；P3和P4引物扩增胎儿弯杆菌16S rDNA基因片段，扩增长度为763 bp；所述引物序列为：

P1：<210>1；

P2：<210>2；

P3：<210>3；