[发明专利]一种适合悬钩子属植物核型分析的染色体制备方法

说明书

技术领域

本发明属于细胞遗传学与细胞生物学领域，涉及一种染色体制备方法，尤其涉及一种适合悬钩子属植物核型分析的染色体制备方法。

背景技术

染色体是生物体内在的遗传物质基础，是遗传物质的主要载体。染色体大小、数目和形态(即核型特征)在植物的生长发育和世代繁衍过程中相对稳定，不易受环境条件变化的影响产生变异，能在很大程度上反映物种特性及其遗传差异。因此，不同物种的染色体核型特征甚至染色体数目可为本属植物分类、系统发育和亲缘关系鉴定提供细胞学依据。当对特定类群细胞内染色体数目、形态和核型等进行比较研究时，供核型分析的染色体标本必须核型特征完整、清晰。目前广泛采用制备植物染色体标本的方法有2种，一是常规压片法(具体原理见李懋学和张敩方，1991)，一是酶解去壁低渗法(陈瑞阳等，1979)。

悬钩子属是蔷薇科(Rosaceae)中一个大属，其形态变异异常丰富。据统计，全世界有悬钩子属植物750-1000种(陆玲娣，1983；Thompson，1997)。由于悬钩子属植物多为多年生木本植物，其染色体数目较多和较小(多为1-3um)，若获得理想的能进行核型分析的染色体标本，采用现有的常规压片法和酶解去壁低渗法，方法流程或繁琐，并有一定的技术难度，或效果不尽理想。比如在我们的对比试验中，采用陈瑞阳等(1979)的去壁低渗法制备适于适于悬钩子属植物核型分析的染色体标本，其方法过程繁琐、技术难度较大，特别是合适酶解去壁时间难把握，而且，酶解去壁需要纤维素酶和果胶酶，标本制作成本较高。而采用李懋学等的常规压片法(1991)，制备悬钩子属植物染色体标本操作流程相对去壁低渗法简单，但相对本申请专利保护的染色体标本制作的方法技术流程，还是需要较长的处理时间，并且适合进行悬钩子属植物核型分析的染色体标本的效果较差。因此，在我们采用本申请专利保护的技术方法流程有效地进行悬钩子属植物的28个种类15个品种的50多个样本的染色体核型分析之前，全世界悬钩子涉及染色体核型研究的物种只有8个种(Pool et al.，1981；Iwatsubo & Naruhashi，1991；陈瑞阳，1993；李秀兰等，1993；林盛华，1994)，其中有6个种使用酶解去壁低渗法，2个物种使用常规压片法获得染色体标本，同样的物种，其染色体标本效果不佳。

现有的植物染色体标本制片技术，一是李懋学(1991)的压片法，一是陈瑞阳(1979)的酶解去壁低渗法。

两种技术的取材和预处理的要求和操作一致，前者操作较后者简便，主要的技术流程依次包括材料的培养和取材、预处理、固定、(保存)、解离，染色和压片。但对木本植物的染色体标本的制备来说，其效果远不及陈瑞阳的酶解去壁低渗法(1979，1993，1994，2003，2003，2008)。因此，下面重点介绍陈瑞阳等的酶解去壁低渗法的详细技术流程。

陈瑞阳等的酶解去壁低渗法(1994)

一 设备、药品

(一)设备：

1 研究显微镜，最好具显微照相设备。

2 培养箱，室温至60℃。

3 蒸馏水重蒸设备，以玻璃制品为优。

4 冰箱，0℃。

5 其他用具：眼科镊子、保安刀片、磨口三角瓶(50-100毫升)、移液管(10、20毫升)、烧杯(50、100毫升)、试剂瓶(250、500毫升)、刻度滴管(1、2毫升)、酒精灯、普通载玻板20×20厘米以上、牙签、青霉素瓶。

(二)药品：

1 秋水仙碱、8-羟基喹啉、对二氯代苯、α-溴代萘。

2 纤维素酶(上海酒精二厂，上海东风试剂厂产品)。

3 果胶酶(SERVA)。

4 Giemsa母液0.5克Giemsa粉加33毫升优质丙三醇于研钵中，充分研磨1小时，然在56℃温箱中保温2小时，再加入33毫升甲醇(GR)，混匀装入试剂瓶内保存备用，储存时间越长越好。

5 甲醇AR级以上。

6 冰醋酸AR级以上。

7 磷酸缓冲液：

A液：0.067M磷酸二氢钾：称取KH2PO4 49.118克，置于容量瓶内加蒸馏水至1000毫升。

B液：0.06M磷酸二氢钾：称取无水Na2HPO49.467克，置于容量瓶内加蒸馏水至1000毫升。

使用时根据pH值的要求按表1所列比例混合：

表1

8 Giemsa染色液：(必须临用前配制)100毫升磷酸缓冲液+3-5毫升Giemsa母液。