[发明专利]使用连续传代的细胞系制备新城疫病毒与疫苗的方法及其制品

说明书

技术领域

本发明涉及一种鸡新城疫病毒与疫苗的方法及其制品，特别是指一种用细胞系制备鸡新城疫病毒与疫苗的方法及其制品。

背景技术

新城疫病毒(NDV)属于副粘病毒科，是一种新城疫病毒单股负链RNA病毒。新城疫是NDV引起的一种急性败血性、高度传染性疾病，死亡率极高，对我国养禽业危害性极大。防治NDV的措施主要靠疫苗接种，特别是弱毒疫苗的应用。目前主要是用鸡胚生产NDV疫苗，而用鸡胚生产疫苗就有可能使疫苗中污染一些垂直传播疾病的病原，致使这些疾病随疫苗的应用而发生传播。使用异原传代细胞制备NDV疫苗，可以避免散播其他疾病的危险。但是新城疫病毒在上述传代细胞中的繁殖不理想，不能实现新城疫病毒在传代细胞中的有效增殖，因此，目前新城疫病毒与新城疫疫苗的制备依然需要在鸡胚中接种并繁殖，而如上所述的鸡胚生产病毒与疫苗的缺点则限制了其应用。

发明内容

有鉴于此，本发明的主要目的在于提供用细胞系生产新城疫病毒与疫苗的方法，特别是使用常见易培养的细胞系如MDCK、VeroE6、BHK-21、PK-15、IBRS-2等细胞系生产新城疫病毒及疫苗的方法。该方法使用培养病毒的细胞系是成熟的商业化的细胞系，具有生产工艺简单稳定、易操作，病毒含量高，批间差异小，质量易控，可显著提高疫苗产量和质量。利用本发明生产的新城疫疫苗安全性好、免疫力高，对新城疫强毒攻击具有完全的免疫保护作用。

技术方案

因此，本发明首先提供了一种用细胞系生产新城疫病毒的方法，包括以下步骤：

1.一种用细胞系生产新城疫病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)细胞的培养：将细胞系经消化传代，以细胞培养液进行培养，形成生长良好的细胞单层；

2)病毒接种与吸附：将新城疫病毒接种于上述生长良好的细胞单层，进行病毒吸附；

3)细胞的孵育：换用细胞维持液培养后，加入300mmol/L的D-氨基葡萄糖(加入量为维持液的0.1％v/v)孵育；

4)病毒的繁殖：将上述孵育剂洗去，重新加入细胞维持液培养细胞系以繁殖新城疫病毒；

5)病毒的收获：收获含有新城疫病毒的培养液。

优选的，本发明所述的步骤2)中接种用的新城疫病毒是使用细胞系生产的新城疫病毒。

优选的，本发明所述的新城疫病毒是新城疫病毒Lasota株。

优选的，本发明所述的细胞系为：MDBK细胞系、VeroE6细胞系、BHK-21细胞系、PK-15细胞系、IBRS-2细胞系的任意一种或几种。

最优选的，本发明所述的细胞系为：BHK-21细胞系。

优选的，本发明所述的孵育剂为D-氨基葡萄糖、干扰素或脂多糖；更优选地，孵育剂为D-氨基葡萄糖。

优选的，本发明所述的细胞孵育时间为20-40min，更优选地，孵育时间为30min

优选的，本发明所述的细胞生长液的血清含量为1％-7％v/v；更优选地，细胞生长液的血清含量为5％-6％v/v；最优选地，细胞生长液的血清含量为6％v/v。

优选的，本发明所述的细胞维持液为无血清的细胞培养液。

本发明的另一目的在于提供上述方法制备的新城疫病毒，所述新城疫病毒为使用细胞系生产新城疫病毒。

本发明的又一目的在于提供一种用细胞系生产新城疫疫苗的方法，即使用上述方法获得的新城疫病毒，加入灭活剂，灭活后加入兽药学上可接受的疫苗佐剂制备为新城疫疫苗。

最后，本发明还提供了一种根据上述方法制备的新城疫疫苗，由于新城疫病毒为使用细胞系生产的，因此，所述新城疫疫苗也是使用细胞系生产新城疫疫苗。

由上可以看出，发明人意外地发现在鸡新城疫病毒繁殖时对细胞系进行细胞孵育可以帮助鸡新城疫病毒适应细胞系，特别是通过在生产用毒种和制苗用病毒中均使用孵育剂进行孵育，使得用细胞系繁殖鸡新城疫病毒成为了可能，从而实现了用细胞系生产鸡新城疫疫苗。而在现有技术中，国内外范围内无论使用MDCK、VeroE6、BHK-21、PK-15、IBRS-2等何种细胞系，或者使用同步培养、带毒传代等方法，都没有实现鸡新城疫病毒在细胞系中获得有效的增殖，并达到利用细胞系生产鸡新城疫疫苗的目的。