[发明专利]含有可诱导型癌基因的细胞系及其建立方法、应用

说明书

技术领域

本发明涉及抗肿瘤药物研发技术领域，尤其涉及一种可诱导K-ras^G12V癌基因表达的细胞系及以此作为筛选模型建立特异性抗肿瘤药物高通量筛选平台。 

背景技术

肿瘤的发生与癌基因的突变关系密切。在大约30％左右的人类恶性肿瘤中，都可以发现RAS家族的基因突变。在某些肿瘤，如胰腺癌、结肠癌等，RAS家族基因突变的百分率更高达40％-90％。这些突变最常发生于K-ras基因。第12位氨基酸(G→V)突变(K-ras^G12V)是K-ras常见的激活性基因突变，特别在是胰腺癌中尤其常见。现代K-ras基因突变的肿瘤病人对化疗和放疗有明显的耐受性，一旦发生K-ras突变，可供选择的治疗方案十分有限，病人的预后通常较差。多年来，研究人员致力于寻找一种对K-ras突变肿瘤有较强细胞毒性的药物。虽然以K-Ras为靶标的抗肿瘤药物的研究取得了一定的进展，但目前临床上仍缺乏一种有效的针对K-ras突变肿瘤的选择性抗肿瘤药物。在技术领域，缺乏高效筛选和鉴定特异性针对K-ras癌基因的药物的方法是目前的主要技术缺陷之一。 

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术不足，建立一种特异性针对K-ras癌基因的选择性抗肿瘤药物高通量筛选平台，该平台可以筛选出对激活突变的K-ras基因有选择性杀伤作用的新型抗肿瘤药物。 

不断发展的高通量化合物筛选技术为寻找以K-ras为靶标的新型抗肿瘤药物提供了新的可行途径。本发明基于高通量筛选技术，以分子和细胞水平的实验方法为基础，以微板形式作为实验工具载体，以自动化操作系统执行试验过程，以灵敏快速的检测仪器采集实验结果数据，以计算机对实验数据进行分析处理， 同一时间对大量样品检测。这种技术具有微量、精确、快速的特点，通过短时间内对大量化合物库的筛选，快速发现先导化合物并对其进行进一步的研究，为临床抗肿瘤药物的研发提供了一条高效、快捷的途径。 

以细胞为基础的高通量药物筛选平台的建立需要合适的细胞模型。四环素(Tet)操纵子调控系统是一种可诱导的基因表达系统。在没有四环素(或强力霉素)存在时，Tet阻遏因子(Tet R)与Tet操纵因子序列(Tet O)结合而阻断四环素抗性基因的表达；在四环素(或强力霉素)存在时，Tet R对Tet O的阻遏解除，下游基因转录启动。通过这个系统，不仅可以对靶基因的表达进行调控，同时也提供了良好的等基因细胞(isogenic)对照。因此，四环素操纵子调控的可诱导靶基因表达系统为高通量药物筛选提供了理想的细胞模型。 

本发明提供一种可被强力霉素(doxycycline)诱导的、含有K-ras^G12V基因突变的基因表达系统，即TRex-K-ras^G12V-293细胞系，其保藏号为CCTCC NO：C201192。四环素诱导表达的TRex-K-ras^G12V-293细胞系，其保藏号为CCTCC NO：C201192，于2011年9月28日提交位于中国武汉的武汉大学的中国典型培养物保藏中心保藏，并经鉴定存活。在该系统中强力霉素发挥控制基因表达的“开关”作用，细胞内没有强力霉素存在时K-ras^G12V不表达，细胞内有强力霉素存在时K-ras高表达，且表达的程度与强力霉素作用的时间正相关。在激活性K-ras癌基因信号的作用下，细胞迅速出现代谢改变，其特征表现在线粒体呼吸功能的下调，糖酵解活跃，乳酸产生率增高等，与温博格效应(Warburger effect)相符合。在长期Tet/on诱导K-ras^G12V表达的情况下，细胞呈现恶性转化，能在软琼脂中生长并形成克隆，在裸鼠体内形成肿瘤。因此，K-ras^G12V癌基因可诱导性表达细胞系在Tet/on合Tet/off两种情况下呈现两种不同的生物学表型(癌型、非癌型)，可用于筛选和鉴定能特异性针对携带K-ras癌基因的肿瘤细胞的化合物。 

所述的细胞系中稳定转入了pcDNA6/TR质粒和含有K-ras^G12V癌基因的pcDNA4/TO-K-ras^G12V质粒。 

所述的pcDNA4/TO-K-ras^G12V质粒上12位密码子含有K-ras^G12V突变的基因序列。