[发明专利]一种鉴定番茄黄化曲叶病毒抗性的方法

权利要求书

1.一种鉴定番茄黄化曲叶病毒抗性的方法，其特征在于按如下的步骤进行：

1）DNA 提取：从收集的发病植株的叶片中提取基因组总DNA；

2）引物的设计：以植物总DNA为模板，设计简并引物-对病毒DNA-A进行PCR扩增，其中扩增所用PCR引物为：

BamHI上^a       g tgggatccac ttctaaatg                         

BamHI下 ^a      ggatcc catattgcaagacagactac          

2356F^b          ggatggaaatgtgctgacct               

BamR ^b          gtggatcccacatattgcaa              

a：扩增全长的DNA-A序列；b：扩增0.4A的DNA-A序列；

    3）扩增产物克隆到pMD-19T载体上，分别命名为1.0A-pMD和0.4A-pMD并转化到DH5a菌液中；

4）串联重复的克隆：用BamHI酶切切下1.0A-pMD的病毒全长DNA；用BamHI切开含有0.4A病毒基因组片段的0.4A-pMD载体；利用试剂盒回收相应大小的片段，利用T4连接酶将二者相连得到1.4A-pMD重组载体，转化至DH5a菌液中；

5）正向串联重复序列的获得：

1.0A和0.4A两个片段，利用引物C扩增阳性克隆菌液，比较大小后选出正向串联的菌落形成1.4A串联的克隆；所用引物为：

PMD19F ^c        cgcc aag ctt gca tgccg              

BamR ^c          gtggatcccacatattgcaa ；             

6）表达载体的构建和转化：

利用KnpI和SalI对含有1.4A TYLCV的1.4A-pMD质粒和植物表达载体pRI 101-An进行双酶切，然后利用T4连接酶将目的片段与表达载体进行连接得到1.4A- pRI，将连接产物转化至大肠杆菌DH5α中；用冻融法将1.4A- pRI直接转化农杆菌LBA4404的感受态细胞，转化后的菌液涂布于含利福平和卡那霉素平板，28℃温箱培养2～3d；挑取单菌落接种于2mI 含利福平50ug／mL 和卡那霉素100ug／mL 的YEB培养基中培养过夜后，取1mI菌液置于1.5mI 离心管，离心收集菌体，加50 L无菌水煮沸10min，取上清作模板进行PCR扩增，扩增产物用1．0% 琼脂凝胶电泳验证；

7）重组质粒的提取与鉴定：

用TAKARAMiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.2.0（50次量）试剂盒进行质粒DNA的微量提取，利用SalI和KnpI双酶切1.4A -pRI，37℃酶切消化1h后琼脂糖凝胶电泳检查结果；

8）序列测定与分析：

数据处理借助DNAMAN Version 6.0（Lynnon Biosoft,QuebeCanada）进行，利用BLAST程序在GeneBank数据库中寻找与DNA-A序列最相近的基因组序列；

9）农杆菌接种及病毒DNA的检测和田间调查：

将含有病毒DNA-A侵染性克隆的农杆菌LBA4404分别接种在含卡那霉素（50 ug/mL）和利福平（50 ug/mL）的YEB液体培养基中，28℃，200 rpm振荡培养48 h，接种时，取一支1 mL的一次性注射器，吸取培养好的农杆菌菌液，在距离供试植株根部1-2 cm处取三点进行韧皮部注射，接种植株置于防虫温室中培养，在注射接种后30天，采集叶片约0.5克，抽DNA-A后进行PCR检测，对植株高度和叶片进行症状的观察。