[发明专利]一种鉴定番茄黄化曲叶病毒抗性的方法

说明书

技术领域

本发明属于植物保护技术领域，涉及番茄黄化曲叶病毒接种鉴定的研究，更具体的说是一种快速、简捷、高效的鉴定天津地区番茄黄化曲叶病毒抗性接种的方法。

背景技术

番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl virus, TYLCV)主要危害番茄、辣椒、茄子、甘蓝和黄瓜等蔬菜以及烟草等经济作物，特别是在番茄上危害更重。针对于TYLCV病毒的发生和危害，如何准确、快速、高效地检测到该病毒的存在和发生，是蔬菜安全可持续生产的迫切需要。

目前，鉴定番茄黄化曲叶病抗性的方法有烟粉虱传毒、嫁接接种和机械传毒等等。其中，嫁接法以嫩病叶做接穗，采用腹接法接种到健康番茄上，它的优点是能够为待鉴定植株提供高含量的TYLCV病毒，但该方法耗时耗力，只适于少量鉴定。机械传播是在人工环境下把感染TYLCV的曼陀罗、心叶烟或潘那利番茄作为毒源，通过机械传播侵染健康番茄植株，成功率较低，且病毒从番茄传到番茄上成功的例子只有很少的报道，因此，在接种中一般不用该TYLCV病毒。在育种进程中最常用的接种方法是烟粉虱接种鉴定法，包括温室中烟粉虱接种、回型笼中烟粉虱接种、露地烟粉虱接种3种类型，但这个方法也有一些缺点：1. 虫口密度不均一对抗性鉴定的影响。若虫口密度过大，一些抗病品种也会表现出感病来；若虫口密度太小，又区分不出抗感品种。目前对虫口密度的要求还没有一个标准。2.虫子逃逸引起病害的大面积发生。烟粉虱的体长一般为1-2mm，它可随着调查人员的进出而逃逸出来，从而给周围番茄产区带来灾害。3.受季节限制。烟粉虱的最佳活动温度是26-28℃，低于15℃虫子基本不活动，也就不能传毒，这就会延缓接种鉴定的进程。

农杆菌接种法是近年来发展起来的一种病毒抗性鉴定方法。利用TYLCV-DNA侵染性克隆，通过根癌农杆菌侵染待鉴定植株，病毒DNA可在植物体内形成、复制、运输并诱发症状。侵染性克隆技术首先在噬菌体病毒Qβ、脊髓灰质炎病毒（poliovirus）中获得成功，植物病毒侵染性克隆由Ahlquist 等（1984）在雀麦花叶病毒（Brome mosaic virus，BMV）首次报道，至今国外已有大量的植物病毒被成功地构建了全长cDNA 侵染性克隆（2008）。Zhang 等（2010,2009）分别构建了番木瓜黄曲病毒的侵染性克隆和上海分离物YLCV-[CN:SH2]的侵染性克隆，证明通过农杆菌注射能诱导出病毒侵染症状。

本发明的研究表明（2011）天津地区的分离物与上海和山东等省的分离物基因序列不同，编码转录激活蛋白的序列有2处突变，导致天津地区分离物与其它地区分离物氨基酸的不同，分别是90位E 到  G和104位H  到 Y，推测这两个突变可能增强了其致病力。

目前，国内还未见天津地区TYLCV的侵染性克隆工作的报道，因此，针对以天津为代表的华北地区抗番茄曲叶病毒栽培专用品种缺乏的现状，开展侵染性克隆构建工作，建立一套方便、可靠、安全的接种新方法，为抗病育种提供一种客观的评价体系，从而筛选培育出具有自主知识产权的专用品种，对于提高番茄市场竞争力，推进蔬菜产业可持续发展具有重要意义。

发明内容

针对传统技术不能准确地对TYLCV抗性进行鉴定的问题，本发明人进行了大量的研究工作，构建了针对天津地区TYLCV的侵染性克隆(代号为TYLCV--TJ)，通过茎杆注射接种番茄黄化曲叶病毒，鉴定不同番茄材料对该病毒的抗性。此方法无需饲养烟粉虱、操作简单、效率高、重复性好、可控性好，能提供相对一致的接种压力，结果准确，是一种简便有效的接种鉴定方法。本发明所公开的技术内容如下：

一种鉴定番茄黄化曲叶病毒抗性的方法，其特征在于按如下的步骤进行：

1）DNA 提取：从收集的发病植株的叶片中提取基因组总DNA；

2）引物的设计：以植物总DNA为模板，设计简并引物-对病毒DNA-A进行PCR扩增，其中扩增所用PCR引物为：

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