[发明专利]制备转TGEV-S基因玉米的方法

说明书

技术领域

本发明涉及制备转TGEV-S基因玉米的方法。

背景技术

猪传染性胃肠炎(Transmissible Gastroenteritis，TGE)是由猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible Gastroenteritis Virus，TGEV)引起的，该病是以呕吐、严重腹泻、脱水和对2周龄以内仔猪高度致死性为特征的高度接触性传染病，不同品种和年龄的猪均易感。TGE主要危害新生仔猪，随着日龄的增大，该病的死亡率逐渐下降，16日龄以上仔猪的死亡率为10％左右。5周龄以上仔猪死亡率更低，成年猪几乎没有死亡，但往往会造成生产性能下降，饲料报酬率降低，经济损失较大。猪传染性胃肠炎病毒S蛋白(TGEV S蛋白)形成病毒粒子表面的突起，携带主要的B淋巴细胞抗原决定族，是唯一能诱导产生中和抗体和提供免疫保护作用的结构蛋白。TGEV S抗原分为A，B，C和D共4个抗原位点，有研究成果证明这四个抗原位点均位于S蛋白N端的543个氨基酸残基之内。

随着植物基因工程技术的发展，利用转基因植物作为生物反应器生产动物或人基因工程疫苗应用在疾病的预防及治疗方面已成为植物基因工程的一个新兴研究领域。和细菌、酵母及哺乳动物细胞等传统疫苗生产系统相比较而言，用转基因植物作为生物反应器生产基因工程疫苗具有以下几个方面的优势：①植物细胞具有全能性，能够再生植株且易于成活；②植物细胞完整的真核细胞表达系统使表达产物具有较好的免疫原性及生物活性；③植物细胞壁、细胞膜和细胞器的天然生物胶囊作用能避免抗原蛋白在消化道中被降解，有效地诱导肠胃黏膜免疫反应，同时又能起到一定的缓释作用，这使得植物疫苗口服给药比经注射给药效果更明显。④口服植物疫苗能诱导粘膜免疫反应。以上这些优点使转基因植物口服疫苗适合应用于通过提高体液免疫特别是肠道免疫水平来预防病原的感染。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种在植物中表达TGEV S蛋白的方法。

本发明所提供的在植物中表达TGEV S蛋白的方法，包括如下步骤：将TGEV S蛋白的编码基因导入出发植物，得到表达所述TGEV S蛋白的转基因植物。

上述方法中，所述出发植物为玉米。

上述方法中，所述编码基因为如下1)或2)或3)或4)所示：

1)其核苷酸序列是SEQ ID NO：2中自5′末端第1-2208位核苷酸所示DNA分子；

2)其核苷酸序列是SEQ ID NO：2所示DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；

4)与1)或2)限定的DNA序列具有90％以上的同源性且编码所述蛋白的DNA分子。

上述方法中，所述编码基因是通过如下所述的重组表达载体导入的。

上述方法中，所述TGEV S蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明的另一个目的是提供一种用于制备转基因玉米的重组表达载体。

本发明所提供的重组表达载体，按照如下方法制备：用SacI和EcoRI双酶切载体pBI221，回收农杆菌胭脂碱合成酶基因NOS3′末端终止子片段，再将其插入载体pSP72的SacI和EcoRI位点间，得到重组载体，计作pBPC18；

将E35S启动子插入pBPC18的HindIII和XbaI位点，得到中间重组载体1；将Hsp70 intron1用BglII和BamHI酶切后插入所述中间重组载体1的BamHI位点，得到重组载体，计作pBAC154；

将所述TGEV S蛋白的编码基因插入载体pBAC154的BamHI和SacI位点，得到重组载体，计作pBAC175；

用HindIII和BamHI酶切质粒pBARGUS，回收含有CaMV 35S启动子和玉米Adh1内含子的目的片段，再将其插入到pSP72的HindIII和BamHI位点，得到中间重组载体2；将编码抗除草剂草甘膦的玉米EPSP基因插入中间重组载体2的BamHI和EcoRI位点，获得重组载体，计作pSHK49；

将pSHK49用EcoRI酶切后补成平端，引入含HindII位点的适配子序列，计作pSHK49H3；所述适配子序列具体为CCCAAGCTTGGG；

用HindII酶切pSHK49H3，回收含有CaMV 35S启动子和玉米Adh1内含子和EPSP基因的片段，将其插入到pBAC175的HindIIII位点，得到目的重组表达载体。