[发明专利]沙门氏菌的切刻内切酶核酸恒温扩增快速检测试剂盒

权利要求书

1.一种沙门氏菌的切刻内切酶核酸恒温扩增快速检测的引物及探针，其中：

正向引物序列为SEQ ID NO：1；

反向引物序列为SEQ ID NO：2；

P1探针的序列为SEQ ID NO：3：

P2探针的序列为SEQ ID NO：4。

2.如权利要求1所述的沙门氏菌的切刻内切酶核酸恒温扩增快速检测的引物及探针，其特征在于所述的P1探针的5′端标记生物素，P2探针的3′端标记FITC。

3.权利要求1所述的引物和探针用于检测食品中的沙门氏菌。

4.一种沙门氏菌的切刻内切酶核酸恒温扩增快速检测试剂盒，包括如下的组分：

(1)模板预处理反应液：

其中包括10×Taq Platinum buffer II反应缓冲液，0.1～1.0mmol/LdNTP，0.1～1.0μmol/L正向引物，0.1～1.0μmol/L反向引物，Taq Platinum DNA Polymerase 2.5U；

所述的10×Taq Platinum buffer II反应缓冲液成分为：200mM Tris-HClpH8.8，100mM KCl，100mM(NH₄)₂SO₄，20mM MgCl₂；

(2)NEMA恒温扩增反应液：

包括10×NE Buffer 3反应缓冲液，0.1～1.0mmol/L dNTP，5％～30％DMSO，0.1～1.0μmol/L正向引物，0.1～1.0μmol/L反向引物和100μg/mL牛血清蛋白；

其中所述的10×NEBuffer 3反应缓冲液成分为：100mmol/L NaCl，50mmol/L Tris-HCl，10mmol/L MgCl₂，1mmol/L dithiothreitol pH 7.9；

(3)Nt.BspQI切刻内切酶：4U/μL；

(4)Bst DNA聚合酶：2U/μL；

(5)5′端生物素标记探针P1和3端FITC标记探针P2各10μmol/L

(6)通用型核酸扩增物快速检测板；

其中正向引物、反向引物和探针P1、P2的序列如权利要求1所述。

5.权利要求4所述的试剂盒用于检测食品中的沙门氏菌。

6.如权利要求5所述的试剂盒，其使用方法包括如下的步骤：

(1)待检样品或细菌DNA的提取： 

提取待检样品核酸，其中提取的样品DNA OD₂₆₀/OD₂₈₀在1.6～2.0范围内，浓度在10～100ng/μL范围内；

(2)模板预处理：

将装有23μL模板预处理反应液的反应管加入2μL待检模板DNA，于94℃水浴7min后迅速放入60℃的水浴中50s；然后94℃水浴20s和60℃水浴50s，此过程反复进行5个以上循环。产物用于NEMA模板；

(3)NEMA恒温扩增反应：

在装有46μL NEMA扩增反应液的反应管中加入2μL预处理过的模板DNA，1.0μL Nt.BspQI切刻内切酶和1.0μL Bst DNA聚合酶后，迅速放入57℃的水浴中60min，反应结束后取出；

(4)产物检测：

反应结束后，反应管中加入探针P1和P2各0.5μL，90℃水浴3min自然冷却至恒温，用通用型核酸扩增产物快速检测板检测产物。