[发明专利]沙门氏菌的切刻内切酶核酸恒温扩增快速检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于致病微生物检测技术领域，具体涉及一种利用切刻内切酶恒温扩增(NEMA)技术进行菌样的快速检测的方试剂盒及其应用。

背景技术

沙门氏菌(Salmonella spp)属于肠道细菌科，包括可引起食物中毒，导致胃肠炎、伤寒和副伤寒的细菌，是一类人畜共致病食源性革兰氏阴性致病菌。沙门氏菌除了可以感染人外，还可以感染很多动物，包括哺乳类、鸟类、爬行类、鱼类、两栖类及昆虫。人畜感染后可呈无症状带菌状态，也可表现出有临床性状。沙门氏菌还可能加重病态或死亡率，或者降低动物的繁殖生产力。据报道，中国的多种细菌性食物中毒事件中，由沙门氏菌引起的数量居首位，全球每年由沙门氏菌导致死亡的人数约60万。最新Kuffman-White抗原表(2007年版)显示沙门菌血清型已有2579种，这样就给传统的生化鉴定方法增加了难度。世界各国把沙门氏菌列为食品卫生重点监测的致病菌之一，该菌也是中国进出口食品、动物饲料法定检验的致病菌。因此，需要建立一种有效的沙门氏菌检测方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种沙门氏菌的切刻内切酶核酸恒温扩增快速检测试剂盒及其检测方法，以克服现有技术的不足，从而为食品安全提供科学的依据和指导作用。

本发明的主要原理如下：

(1)设计一对5′端带切刻内切酶识别序列的引物和一对分别由生物素和FITC标记的探针；

(2)把引物和目标菌的模板DNA加入到模板预处理反应液，在Taq Platinum DNA聚合酶作用下，通过几个预变性和扩增的循环过程，把切刻内切酶识别序列引入到待扩增序列中，作为NEMA恒温扩增的模板；

(3)切刻内切酶识别NEMA模板上的识别序列，在其中一条核酸链上切割形成切口，暴露其3′端；

(4)在具有链置换活性的Bst DNA聚合酶的作用下，以暴露的3′端为起点，以未被切断的另一条核酸链为模板，合成新的双链核酸，旧链被剥离下来成为下一轮核酸合成的模板，同时在新合成的双链核酸上恢复切刻内切酶识别位点；

(5)切割、延伸和剥离的步骤重复进行，扩增出大量靶核酸序列；

(6)扩增产物利用通用型核酸扩增物快速检测板检测。

核酸扩增完成后，在反应管中加入探针与扩增产物杂交。把检测板水平放置在操作台上，取杂交产物10μL加入检测板的样品孔中，再加入100μL缓冲液进行层析，10min左右判读结果。

通用型核酸扩增物快速检测板(杭州优思达生物技术有限公司批号20101026-2)的上C为质控区，T为检测区。检测板在质控区C和检测区T均出现红色条带，为阳性结果，表明样本中含有检测的目标物；仅在质控区C出现红色条带，为阴性结果，表明样本中为检出目标物；质控区C和检测区T内均无红色条带出现，表明快速检测板失效。

本发明的一个方面涉及沙门氏菌的切刻内切酶核酸恒温扩增快速检测的引物及探针，其中正向引物序列为SEQ ID NO：1：

5-CCTTCGCTCATTTTGCTCTTCAATCGACGGACATCGACAGAC-3；反向引物序列为SEQ ID NO：2：

5-AAGGGATCCGACAGGCTCTTCGCAGTACCTTCCTCAGCCTTG-3。

其中正向引物和反向引物中下划线部分为切刻内切酶识别位点；

P1探针的序列为SEQ ID NO：3：

P1：5-CCTTCCTCAGCCTTGACCCGG-3         5端标记生物素；

P2探针的序列为SEQ ID NO：4：

P2：5-TGTCCTCCTTACGTCTGTCGATGTCC-3    3端标记FITC。

本发明的另一个方面涉及一种沙门氏菌的检测试剂盒，包括如下的组分：

(1)模板预处理反应液：

其中包括10×Taq Platinum buffer II反应缓冲液，0.1～1.0mmol/L dNTP，0.1～1.0μmol/L正向引物，0.1～1.0μmol/L反向引物，Taq Platinum DNA Polymerase2.5U；

所述的10×Taq Platinum buffer II反应缓冲液成分为：200mM Tris-HCl pH8.8，100mM KCl，100mM(NH₄)₂SO₄，20mM MgCl₂；