[发明专利]一种用于生产谷胱甘肽的毕赤酵母工程菌

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种用于生产谷胱甘肽的毕赤酵母工程菌。

背景技术

谷胱甘肽作为一种重要的小分子三肽化合物，它广泛存在于动植物组织、细胞和微生物细胞中。谷胱甘肽最早在面包酵母中被发现，于1921年正式被命名为谷胱甘肽。谷胱甘肽的全称是γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酰-甘氨酸(γ-L-glutamyl-L-cysteinyl-glycine，GSH)，是由谷氨酸(Glu)、半胱氨酸(Cys)和甘氨酸(Gly)通过肽键缩合而成的，结构式如下：

通常GSH以还原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽两种形式存在，其分子量为307.33，熔点为189～193℃，晶体呈无色透明细长蜡状，等电点为5.93，易溶于水、稀醇、液氨和NN.二甲基甲酰胺，微溶或不溶于乙醇、醚和酮。研究表明只有还原型谷胱甘肽(GSH)具有生理活性，由于每分子还原型谷胱甘肽含有一个活泼的疏基，当GSH溶解在水中时，两分子还原型谷胱甘肽的活泼疏基会氧化缩合为二硫键，得到氧化型谷胱甘肽(简称GSSG，GSSG是两分子GSH脱氢后通过二硫键相联的二聚体)，因而GSH的溶液在空气中易被氧化。然而固体的GSH却比较稳定。

在生物体内，谷胱甘肽是一种主要的还原性物质，它参与细胞内的多种氧化还原反应来维持细胞内适宜的氧化还原状态；参与体内氨基酸的转运和解毒过程；参与血管保护；抗HIV和抗衰老作用等。由于GSH具有很多方面的生理功能而被广泛应用于医学、食品、化妆品行业。在医学临床应用方面，谷胱甘肽能够抑制艾滋病病毒，治疗眼角膜病的功效，还可以向肝脏提供甘氨酸及牛黄酸，保证甘氨酸及牛黄酸的结合胆碱的合成，促进消化道对脂溶性维生素(A、D、E、K)的吸收，从而促进肝脏合成维生素K依赖性凝血因子的生成，减轻出血倾向。在食品加工方面，谷胱甘肽可以改善食品的品质、增强食品的风味、延长食品保质期。在化妆品生产方面，谷胱甘肽能够保护细胞免受辐射的伤害，同时起到美白作用。

工业化生产GSH主要采用化学合成法、固定化细胞(或酶)法、发酵法。化学合成法生产GSH工艺已较成熟，但存在成本高、反应步骤多、反应时间长、操作复杂、需光学拆分且存在环境污染等问题；酶法生产谷胱甘肽需要获得相关的酶系，需要消耗ATP，需要加入前体氨基酸等物质，造成成本较高；发酵法生产GSH就是选育(或构建)GSH合成能力强和胞内含量高的微生物、筛选和优化培养基配方、建立和优化发酵控制策略、改进和提高下游过程技术等，最终提高GSH的产率和质量。由于该方法所用原料可再生，产物对环境无污染等优点而越来越受人们的关注。

目前国内外发酵法合成GSH的菌种主要是酿酒酵母、产朊假丝酵母等，而生产菌株主要依靠传统的诱变育种方法获得。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种构建重组菌的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：将双功能谷胱甘肽合成酶的编码基因导入出发菌，得到重组菌；

其中，所述双功能谷胱甘肽合成酶来源于单增李斯特菌(Ltsterta monocytogene)。

在上述方法中，所述双功能谷胱甘肽合成酶的氨基酸序列为序列表中的序列2；

在上述方法中，所述双功能谷胱甘肽合成酶编码基因的核苷酸序列具体为序列表中的序列1。

在上述方法中，所述双功能谷胱甘肽合成酶的编码基因通过重组载体导入出发菌。

在上述方法中，所述重组载体为将所述双功能谷胱甘肽合成酶的编码基因插入pGAPZαH中的ClaI和NotI酶切位点间，得到表达双功能谷胱甘肽合成酶的重组载体；

在上述方法中，所述pGAPZαH为将his4的编码基因插入pGAPZαA的BamHI和BglII位点间得到的载体；

所述his4的编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列3。

在上述方法中，所述出发菌为毕赤酵母菌(Pichia pastoris)；

在上述方法中，所述毕赤酵母菌(Pichia pastoris)具体为GSl15。

由上述方法制备的重组菌也是本发明保护的范围。

本发明的另一个目的是提供一种重组载体。

本发明提供的重组载体，为将双功能谷胱甘肽合成酶的编码基因插入pGAPZαH中的ClaI和NotI酶切位点间，得到表达双功能谷胱甘肽合成酶的重组载体；

在上述重组载体中，所述双功能谷胱甘肽合成酶的氨基酸序列为序列表中的序列2；