[发明专利]七个抑制BMPR-1B基因表达合成的shRNA分子

权利要求书

1.七个抑制BMPR-1B基因表达合成的shRNA分子，其特征在于：依据GeneBank 中绵羊BMPR-1B基因，即NM-001009431.1序列；设计34条shRNA分子，针对不同位点的shRNA序列进行合成，将合成的两条互补单链的shRNA分子经退火形成双链后，分别连接到pLL3.7慢病毒干扰载体上,构建了8个慢病毒干扰RNA质粒，将pLL-BMPR-1B-shRNA干扰RNA质粒与BMPR-1B表达载体经脂质体转染293T法产毒，经荧光PCR及Western blot的检测，确定7个显著抑制BMPR-1B基因表达的shRNA分子； 

其中使用的引物：

①LV-BMPR-1B-749  

Sense : 5’TGGACAATAGCAAAGCAAATTTCAAGAGAATTTGCTTTGCTATTGTCCTTTTTTC-3’(55bp)；Antisense: 5’ TCGAGAAAAAAGGACAATAGCAAAGCAAATTCTCTTGAAATTTGCTTTGCTATTGTCCA-3’ (59bp )；

②LV-BMPR-1B-803 

Sense : 5’ TGTAGATGTTTCAAGGTATATTCAAGAGATATACCTTGAAACATCTACTTTTTTC -3’  (55bp)；

Antisense: 5’ TCGAGAAAAAAGTAGATGTTTCAAGGTATATCTCTTGAATATACCTTGAAACATCTACA-3’ (59bp)；

③LV-BMPR-1B-1306 

 Sense : 5’ TGATGAGAGCTTGAACAGAATTCAAGAGATTCTGTTCAAGCTCTCATCTTTTTTC；-3’(55bp)；Antisense: 5’ TCGAGAAAAAAGATGAGAGCTTGAACAGAATCTCTTGAATTCTGTTCAAGCTCTCATCA-3’ (59bp)；

④LV-BMPR-1B-1475

Sense : 5’ TTGAGAGAGATCGTGTGTATTTCAAGAGAATACACACGATCTCTCTCATTTTTTC

-3’ (59bp)；

Antisense: 5’ TCGAGAAAAAATGAGAGAGATCGTGTGTATTCTCTTGAAATACACACGATCTCTCTCAA-3’ (59bp)；

⑤LV-BMPR-1B-1685

Sense : 5’ TGGACAAAGCCAGTAGATATTTCAAGAGAATATCTACTGGCTTTGTCCTTTTTTC

-3’(59bp)；

Antisense: 5’ TCGAGAAAAAAGGACAAAGCCAGTAGATATTCTCTTGAAATATCTACTGGCTTTGTCCA-3’(59bp)；

⑥LV-BMPR-1B-2567

Sense : 5’ TGTAAGAAGATGGTGTCAAATTCAAGAGATTTGACACCATCTTCTTACTTTTTTC -3’(59bp)；Antisense: 5’ TCGAGAAAAAAGTAAGAAGATGGTGTCAAATCTCTTGAATTTGACACCATCTTCTTACA-3’(59bp)；

⑦LV-BMPR-1B-2745

Sense : 5’ TGAGGAAACGTATCAGGTTATTCAAGAGATAACCTGATACGTTTCCTCTTTTTTC-3’(59bp)；   Antisense: 5’ TCGAGAAAAAAGAGGAAACGTATCAGGTTATCTCTTGAATAACCTGATACGTTTCCTCA -3’(59bp)；

其中shRNA分子的获取 

1） shRNA慢病毒载体的构建

各取10UL 10uM 的两条siRNA寡核苷酸，即为正链和互补链；加入8μL 10×annealing buffer和12μL 灭菌超纯水，煮沸10分钟后冷却至室温；同时用pLL3.7质粒载体经XhoI和HpaI双酶切后回收质粒，与退火产物4℃过夜连接，连接产物转化DH5a感受态细胞，即用LB平板氨苄青霉素100ug/uL；用载体检测引物及shRNA寡核苷酸引物筛选阳性克隆，并送上海生工所测序鉴定，提取纯化重组质粒用于转染；

2 ） plex-bmpr-1b 、Lv-BMPR-1B-shRNA慢病毒的制备

铺板，每10cm 面积中铺5×10⁶个293T细胞；Lipectamine2000脂质体转染，在含有脂质体和DNA复合物的试管中加入1.5ml预热的OPTI-MEM^?Ｉ培养基，加入目的载体及病毒包装载体，其载体的加量分别为：转染载体 lv- bmpr-1b -shRNA 12ug、REV 6ug、pMDL 6ug、VSVG 6ug； plex-bmpr-1b12 ug、Pspax₂ 9ug、PMD2.G3.5 ug，轻轻混匀，室温放置5分钟，之后将上述稀释好的DNA与脂质体混合，置于室温孵育20分钟，此时用OPTI-MEM^?Ｉ培养基清洗液转染细胞一次；将脂质和DNA复合物加入细胞，置于37℃培养箱，培养4-6小时，换10mL新鲜的DMEM完全培养基，继续培养48-50小时，收集病毒,此时的病毒直接用于转染或置于-70℃备用；

3） 重组Lentivirus感染的Hek293细胞系

将滤过的重组0.5 mL Lentivirus和0.5 mL培养液，以体积比1：1混合，加入浓度为10μg/mL的聚凝胺1μL,将病毒加入细胞，置于32℃培养箱14-16h，移回37℃培养箱孵育4-6h，更换新鲜培养液，在37℃培养箱继续培养，感染48-52h，将6孔培养皿中的细胞转入100mm培养皿中，1-1.5h加入含有浓度为600ng/ mL的Puromycin的选择性培养液；每隔2-3天更换选择性培养液， 2-3周获得稳定转染的细胞；

4） shRNA病毒载体感染含BMPR-1B的Hek293细胞系

感染前按每孔4×10⁵个/mL的密度将表达BMPR-1B的Hek293细胞接种于六孔板,用2mL含有10%胎牛血清的DMEM培养液培养细胞，24-26h备用；将500μL 的shRNA干扰病毒与500μL含有10%胎牛血清的DMEM培养液培养细胞，以体积比1：1混合，同时加入1μL 10μg/mL 的Polybrene , 24-30h，更换含有10%胎牛血清的DMEM完全培养液，再培养24-28h收获细胞；用Trizol法提取总RNA及细胞蛋白裂解液提取蛋白；

5） siRNA抑制效果在Hek293细胞系上的评价

PCR 反应体系：2хmaster mix 10μL,上下游（10pm）个0.8μL；cDNA 2μL；PCR反应条件：95℃ 10s,58℃ 20s,72℃ 20s,55个循环后进入溶解曲线分析程序：40℃-99℃，即为0.1℃/s；通过定量分析得出：pSi749能够有效抑制68.3%的BMPR-1B的转录，pSi803能够有效抑制71.2%的BMPR-1B的转录，pSi1306能够有效抑制99.86%的BMPR-1B的转录，pSi1475能够有效抑制99.78%的BMPR-1B的转录，pSi1685能够有效抑制96.42%的BMPR-1B的转录，pSi2567能够有效抑制94.37%的BMPR-1Bp的转录，Si2745能够有效抑制80.5%的BMPR-1B的转录；

其中细胞蛋白裂解液：由50mM Tris，pH7.4，150mM NaCl,1% N P-40,0.1% SDS配制，混合均匀后使用。

2.根据权利要求1所述合成的shRNA分子，其特征在于：Opti-MEM培养液和DMEM培养液，购自美国Gibco公司； XhoI和HpaI双酶切，购自美国TAKARA公司；染载体pLL3.7由周文来，即美国加州大学圣地亚哥分校医学部, 霍华德休斯医学研究所提供； plex 购自美国Openbiosystem公司；包装质粒pMDL，REV，PMD2.G购自美国biosystem公司； Pspax2；VSVG由李文蓉，即美国克罗拉大学提供。