[发明专利]七个抑制BMPR-1B基因表达合成的shRNA分子

说明书

技术领域

 本发明涉及能够对骨形成蛋白受体-1B(BMPR-1B)基因产生显著抑制作用的小干扰RNA分子的设计、合成和抑制作用在卵母细胞上的评价方法。

背景技术

BMPR-1B基因是一种增加排卵率的调控基因，属于TGF-?超家族成员，又称为ALK6基因；ALK6 突变是在Booroola母羊(FecB)中发现的第一个点突变，发生在高度保守的胞内激酶区，核苷酸830处（A830G），引起精氨酸代替了谷氨酰胺(Q249R)；其显性表现型为卵泡发育提前以及产多胎。文献检索披露：(1)Biol.Reprod.64,1225-1235作者：Wilson,T.等发表《表现为多胎性状的Booroola羊，在卵母细胞和颗粒细胞表达的ALK6基因的一个突变》文章内容是携带Fec^B纯合子的母羊其排卵率升高，伴随着大量囊状卵泡比Fec^B+杂合子的母羊提前成熟并发生排卵；因此，携带Fec^B纯合子母羊其排卵前卵泡提前达到了最大直径并维持在一定水平，直到排卵，导致最终卵泡生长动力学发生了变化。(2)ReproductiveBiologyandEndocrinology2006,4:20doi:1184/1477-7827-4-20作者Stéphane Fabre等发表《在哺乳动物中调节排卵率：羊基因模型的作用》文章，内容是BMP15,GDF9,BMPR-1B这三个基因型来理解BMP系统的作用作为卵巢内滤泡生长和成熟的调节最后影响排卵率。(3)Reproduction (2011) 141 643-651作者Wei Wang等发表《RNA分子干扰猪的含有内源性SMAD4的颗粒细胞导致的FSH介导的颗粒细胞的增值和类固醇合成的减少》文章内容是在猪的颗粒细胞上用RNA干扰的方法敲低了SMAD4，结果显示了SMAD4-siRNA抑制了SMAD4的mRNA和蛋白的表达并抑制了FSH引起的猪颗粒细胞的分化和雌二醇的分泌和细胞周期蛋白的表达。

关于BMPR-1B基因shRNA分子的研究，ALK6 基因干扰的小鼠并没有像Booroola母羊一样表现出多胎性状，且卵泡发育和排卵率都表现正常，但其软骨形成受到影响，骨骼肌发育存在缺陷,说明ALK6 突变存在种属差异,针对其它家畜品种，如绵羊、山羊、猪等，均未见报道。

本发明构思根据绵羊BMPR-1B基因cDNA序列，自行设计合成的shRNA分子，通过功能验证，从设计的shRNA分子库中，筛选到7个对绵羊BMPR-1B基因均有显著抑制作用的shRNA分子，为绵羊生物学研究拓展了应用领域。

发明内容

本发明的目在于：通过对照组细胞BMPR-1B表达水平，从8种shRNA分子中筛选到7个具有显著抑制效果的shRNA分子，在mRNA水平上抑制效率可达90%以上，而对BMPR-1B蛋白的抑制可达80%以上。

 本发明的目的是这样实现的：根据GeneBank 中绵羊BMPR-1B基因(NM_001009431.1序列)；从启始密码（ATG）至终止密码（TGA）共1515bp编码区序列，用shRNA设计软件设计干扰BMPR-1B基因转录的shRNA分子群,从设计的34条shRNA分子中，根据结构和位置筛选出8条针对不同位点的shRNA序列进行合成；将合成的两条互补单链的shRNA分子经退火形成双链后，分别连接到pLL3.7慢病毒干扰载体上,构建了8个慢病毒干扰RNA质粒（pLL-BMPR-1B-shRNA），干扰RNA质粒与BMPR-1B表达载体经脂质体转染293T法产毒，携带BMPR-1B的病毒稳定感染Hek293细胞系，然后携带干扰RNA病毒感染携带BMPR-1B的Hek293细胞系，通过实时定量荧光PCR及Western blot从mRNA及蛋白水平分析了BMPR-1B的表达，以及shRNA对BMPR-1B的干扰抑制作用，通过分析和比较实验组与对照组细胞BMPR-1B表达水平，从8个shRNA分子中筛选到7个具有显著抑制效果的shRNA分子，在mRNA水平上抑制效率可达90%以上，而对BMPR-1B蛋白的抑制可达80%以上，最终确定的7个显著抑制BMPR-1B基因表达的shRNA分子；

其中使用的引物：

①LV-BMPR-1B-749