[发明专利]一种快速鉴别天花粉类药材的分子生物学方法

说明书

技术领域

 本发明涉及一种鉴别天花粉及其类似品的分子鉴别新方法，属于中药技术领域。

背景技术

栝楼属植物全世界有84种8变种，中国有37种6变种。本属有多种药用植物，药典2005年版收载了2种，《中药志》收载了7种，例如栝楼T.kirilowii Maxim．，其果实（瓜蒌）、根（天花粉）都是常用中药。从天花粉中提出的天花粉蛋白已广泛应用于早期和中期妊娠引产，治疗宫外孕、葡萄胎等疾病，近年又用于艾滋病的治疗。调查发现各地所用天花粉来源复杂，不同植物来源的天花粉，其疗效也不完全一致，某些混淆品如湖北栝楼、木鳖子根等还有一定的不良反应。

准确鉴别植物基源是正确开发利用和用药安全有效的基础，已有随机扩增多态性 DNA以及蛋白免疫检测等方法对天花粉及其混淆品进行鉴别的探索。但存在结果重复性欠佳，易受到药材产地及储存时间影响的缺点，在中药材分子鉴定领域的应用受到一定限制。针对 RAPD的缺点，本发明进行了大胆的创新，包括在栝楼属已知 DNA序列上设计 20bp的单引物，提高PCR退火温度等。通过对3个引物的筛选，得到能对天花粉及其伪品 DNA产生多态性图谱的引物，确定了天花粉及其各种混淆品的特征电泳条带，为天花粉类药材鉴别提供了快捷准确的方法。

发明内容

本发明在引物设计和退火温度 2个关键的环节上实现了大胆的创新。引物设计在天花粉类药材已知的 ITS上进行，长度为20bp左右，遵循一般引物的设计原则。同时，退火温度也根据多态性条带的多少进行筛选确定。

具体实施方式

根据天花粉核糖体RNA基因中ITS序列设计3个单引物：TkS1-64F、Tks2-1 12F、Tks2-130R。PCR反应体系为25μL，其中Tris-HCI(pH 9．0)10mmol·L^-1，KC1 50mmol·L^-1，Mg²⁺1.5 mmol·L^-1，dNTP各 0.15 mmol·L^-1，Taq 1U(promega)，Primer 0.15 μmol·L^-1，模板 DNA 50 ng。扩增在 ABI9700上进行，扩增程序为95℃预变性 4 min，接着进行 40个循环：95℃变性30s，50℃退火45s，72℃延伸60s，循环结束后72℃延伸5min。

3个引物中TkS1-64F扩增效果好，表现为天花粉均能扩增，伪品大多数能够扩增，多态性条带 1-5条，条带清晰，重复性好，能用于天花粉药材的鉴别。天花粉的特征鉴别条带确定为560，960 bp条带，1930，1400，839，715 bp等条带可作为天花粉的辅助鉴别带。