[发明专利]抗结核抑制剂筛选的靶标基因Rv2498c及应用

说明书

技术领域

本发明属于药物分子学技术领域，具体涉及一种结核分枝杆菌基因Rv2498c在筛选抗结核抑制剂靶标中的应用。

背景技术

结核分枝杆菌是一种严重危害人类健康的病原菌，据世界卫生组织统计，全世界每年大约有三百万人死于结核病，并且全球约有三分之一的人口感染处于潜伏状态的结核分枝杆菌(WHO，2009)。目前，结核病化学疗法有一线和二线药物的混合剂构成。实际的结核病治疗需要6～9个月，导致了严重的毒性和抗药性。从引进抗结核药物时便不断出现抗药性结核分枝杆菌菌株。事实上，由于具有不寻常的细胞壁，分枝杆菌天然地对大多数常用抗生素具有抗性。此外，遗传学改变也使其获得抗药性。由于结核分枝杆菌菌株对越来越多的用于治疗多重抗药性结核病(multidrug-resistant tuberculosis，MDR-TB)的二线药物产生抗性，因此其已成为世界范围公共健康的威胁(Gandhi et al，2010)。近年来出现的药物抗性菌株以及与HIV的共感染问题，使得这一形式更加严峻。因此，寻找新的药物靶标并研发新的抗结核药物和诊断工具已经迫在眉睫(Ginsberg and Spigelman，2007)。特别地，需要具有新作用机制的对抗药性菌株具有活性的新药物。相应地，还存在鉴定新药物靶标的迫切要求。

在研发新的抗结核药物中，常规的筛选方法是使用化合物库进行批量筛选，在Bryk R及其同事的相关工作中，抑菌试验一共使用了15,000个化合物(Bryk R et al，2008)，工作量大，费钱费力，结核分枝杆菌是一种病原菌，无法常规操作，需要寻找特异性好，命中率高的抑制剂。目前在结核分枝杆菌中基于结构的药物设计是研发新的抗结核药物的有效手段，但是相关的研究只进行到筛选出潜在的药物小分子，没有进行抑菌试验(Cui T at al，2009；Dube D et al，2008)，导致无法评估所筛选到的小分子是否具有潜在的应用价值。

结核分枝杆菌中Rv2498c基因编码柠檬酸裂合酶β亚基CitE(又称柠檬酰辅酶草酰乙酸裂合酶或是柠檬酰辅酶裂合酶，EC：4.1.3.6)，柠檬酸裂合酶在能量代谢和合成方面起着重要的作用，它参与催化柠檬酰辅酶-ACP生成乙酰辅酶-ACP和草酰乙酸的反应(Goulding et al，2007)。结核分枝杆菌的Rv2498c基因可能参与了一种新的脂肪酸合成途径或者部分参与无氧能量代谢(Goulding et al，2007)。这说明Rv2498c基因与结核分枝杆菌的能量代谢密切相关，它是潜在的作为药物靶标的理想选择。然而，到目前为止，尚未有人报道具有抗结核效应的Rv2498c的抑制剂。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，通过分子设计方法，获得一种新的结核病治疗药物的靶标。本发明的另一个目的是针对Rv2498c天然底物结合位点筛选的小分子化合物体外抑菌试验中确实能起到抑菌作用。确定结核分枝杆菌中的Rv2498c是一种合适的抗结核抑制剂筛选的靶标。

本发明是这样实现的：首先通过运行分子对接程序来从小分子化合物数据库中筛选与Rv2498c天然底物结合位点具有高亲和力的小分子化合物。本发明获取结核分枝杆菌Rv2498c的蛋白质序列(编码该蛋白质的序列可以从Http://genolist.pasteur.fr/TubercuList(TubercuList 万维服务器；Rv2498c基因坐标：从2812355到2813176获得)，其全长包含273个氨基酸残基。结核分枝杆菌Rv2498c与草酰乙酸离子复合物的结构已经解析出来了(PDB ID：1Z6K)(Goulding et al，2007)。在本发明中，该蛋白质与草酰乙酸离子复合物结合的空腔被选作对接化合物的活性位点。利用所获得的三维结构信息和活性位点信息，在计算机上构建了一个针对结核分枝杆菌Rv2498c的计算机辅助药物筛选系统，然后运用该系统从小分子化合物数据库中筛选与之活性位点有高亲和力的化合物分子。

其次，本发明测定了小分子抑制剂对结核分枝杆菌的抑菌作用。为了确定哪些抑制剂分子具有体外抑菌活性，将50μg/ml的候选抑制剂添加到结核分枝杆菌的细菌培养物中。将添加了抑制剂的细菌培养物于37℃培养7～8天，通过读取各OD值并与对照进行比较来判断细菌生长是否受到抑制。其中对照1是不用抑制剂组的处理，对照2是使用利福平组的处理，实验过程中的数据是与两个对照比较来评价利用所述候选抑制剂得到的抑制效果，