[发明专利]猪O型口蹄疫重组噬菌体疫苗及其构建方法

权利要求书

1.猪O型口蹄疫重组噬菌体疫苗，其特征在于，以重组T7噬菌体为抗原，所说的重组T7噬菌体表面表达有氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的Mya98谱系FMDV VP1(129-169)位多肽，所说的VP1(129-169)多肽是由单拷贝VP1(129-169)基因插入T7噬菌体P10B基因下游融合表达获得。

2.根据权利要求1所述的猪O型口蹄疫重组噬菌体疫苗，其特征在于，所述Mya98谱系FMDV VP1(129-169)位多肽基因选自以下序列的核苷酸：

1)具有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列；

2)具有SEQ ID NO：1所示序列经改变、缺失或增加一个或几个核苷酸但仍表达具有VP1主要抗原活性多肽的核苷酸序列。

3.根据权利要求1所述的猪O型口蹄疫重组噬菌体疫苗，其特征在于，所说的疫苗中还包含用于乳化重组T7噬菌体的白油佐剂。

4.权利要求1-3中任意一种猪O型口蹄疫重组噬菌体疫苗的构建方法，其特征在于，包括下列步骤：

A、构建重组噬菌体

(1)合成一段DNA序列，该DNA序列克隆至pUC-19载体多克隆位点中，DNA序列的5’端有酶切位点EcoRⅠ，3’端含有酶切位点HindⅢ，其DNA序列如SEQ ID NO：3所示；

(2)用限制性内切酶EcoRⅠ、HindⅢ将上述DNA序列从pUC-19载体上切下后插入T7噬菌体多克隆位点的EcoRⅠ和HindⅢ之间，构建重组噬菌体；

(3)用T7噬菌体包装蛋白组装重组噬菌体，包装产物通过琼脂糖夹心法扩增，用PCR方法筛选阳性重组噬菌体，重组噬菌体展示FMDV VP1129-169位多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；

B、重组噬菌体的制备

    甘油冻存的E.coli BL21菌株在LB体培养基平面上划线接种，37℃过夜培养；从平皿上挑取单菌落，接种5mL LB培养液，37℃、200转/分震荡培养过夜，取3mL过夜培养物接种300mL LB培养液，培养至OD₆₀₀=0.8左右，挑取平皿上的单个噬菌斑，接种到培养好的BL21宿主菌中，37℃、100转/分震荡培养2-3小时，直至菌液由浑浊变为澄清，用PEG沉淀的方法回收噬菌体，并按常规的方法测定噬菌体滴度，将回收的噬菌体调整浓度为2×10¹³pfu/mL，并按照4‰的比例加入甲醛溶液，37℃、100转/分震荡灭活过夜；

C、制备重组噬菌体油乳剂疫苗。

5.根据权利要求4所述的猪O型口蹄疫重组噬菌体疫苗的构建方法，其特征在于，所述的重组T7噬菌体的载体为T7 Select 415-1b。