[发明专利]猪O型口蹄疫重组噬菌体疫苗及其构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及T7噬菌体展示猪O型口蹄疫病毒VP1蛋白主要抗原表位的重组噬菌体构建及应用，属于分子生物技术领域。

背景技术

口蹄疫(FMD)是偶蹄动物的一种急性、烈性传染病，严重威胁动物及其产品的国内外贸易乃至于人类的健康。FMD一旦暴发，随之而来所采取的封锁、隔离、扑杀牲畜等强制措施将给发病国家或地区带来重大的经济损失。因此，FMD一直被世界动物卫生组织(OIE)列在A 类传染病之首。口蹄疫的病原为口蹄疫病毒，是小RNA病毒科，口蹄疫病毒属成员。病毒粒子为二十面体，无囊膜，直径20～30nm，结构比较简单，完整的病毒颗粒包括衣壳和RNA两部分，病毒的RNA为单股正链RNA，全长8.5kb。

O型FMDV至少有5个中和性抗原位点。位点1由VP1的G-H环和C 端氨基酸残基的线性表位组成，从病毒中分离的VP1可以诱导动物产生相应中和性抗体，该位点是FMDV最重要的抗原位点，也是FMDV抗原变异关键所在。位点2位于病毒表面VP2的B-C环和E-F环上，在三重轴附近，由4个表位组成。位点3位于病毒表面五重轴周围VP1的B-C环。位点4位于五重轴周围VP3的B-B“结节”上。位点5位于VP1的G-H环内，与位点1是相互独立的。它们在功能上都是独立的，但是在单拓扑结构上很可能有重叠。抗体竞争试验表明，位点1、2和3在拓扑结构上是独立的，位点2和4在拓扑结构上是关联的。

研究表明，结构蛋白VP1～VP4均参与抗原位点的形成，但发挥主要作用的是VP1，该基因位于FMDV基因组的2977～3615位核苷酸，编码213个氨基酸。结构蛋白VP1功能区内包含FMDV的主要抗原位点，能诱导感染动物产生中和性抗体，其中第140～160位氨基酸处的G-H环是主要的保护性抗原位点,有连续的B细胞表位，具有较大的运动性,在其顶部形成了一个高度保守的Arg-Gly-Asp (RGD)序列，是FMDV的细胞受体位点。其次，在C端200～213位氨基酸残基有T细胞抗原表位。

T7噬菌体是感染大肠杆菌的小型烈性噬菌体，基因组为线状双链DNA，长39 936bp。其衣壳蛋白包括主要头蛋白(P10A)、次要头蛋白(P10B)、颈圈蛋白(P8)、尾蛋白(P11、P12)和尾丝蛋白(P17)，其中P10A和P10B是由p10编码的是一对重叠蛋白，P10A有344个氨基酸残基，P10B有397个氨基酸残基，是在P10A的phe341处翻译移码产生的，在野生型T7噬菌体中，P10B约占衣壳蛋白总量(415拷贝)的10%。对T7噬菌体的生物学特性，己经做过全面深入地研究，基因组全部序列己经测定。与入噬菌体和丝状噬菌体相比，T7噬菌体更易培养且繁殖更快，37℃下3h形成噬菌斑，感染后1-2h完全裂解。

T7噬菌体展示系统是一种新型的展示系统，对p10进行了改造，自然状态下的翻译移码位点被去除，并在348位氨基酸之后重组入了一个多克隆位点，使得基因组中仅表达改造后的P10B (415拷贝)，因而可以将外源肽段以融合蛋白的形式展示在P10B上。T7噬菌体展示系统具有操作简便、复制周期短、容易培养、生长迅速、系统稳定、勿需分泌到周质或膜外而是直接展示，

重组噬菌体疫苗具有以下优势：噬菌体作为表达产物的载体展示的是生物体自身翻译机制产生的天然构象产物，能很好的诱发机体的抗原-抗体免疫反应；噬菌体有较强的免疫原性，在噬菌体表面表达的多肽易于接近抗体，容易被免疫系统识别；噬菌体可以募集T辅助细胞，而且噬菌体颗粒的不对称性有利于引发T细胞依赖的免疫反应；由于噬菌体颗粒是由感染的细菌分泌，噬菌体颗粒可以方便的大规模生产疫苗用抗原表位，还可以在同一噬菌体上展示多个具有保护性作用的抗原决定簇，构建多价疫苗；噬菌体生长迅速，纯化简单、花费少；噬菌体颗粒稳定，对理化因素的抵抗力强。

发明内容

本发明的目的是克服现有多肽疫苗技术的不足之处，提供一种高效的猪O型口蹄疫重组噬菌体疫苗。

本发明的猪O型口蹄疫重组噬菌体疫苗，以重组T7噬菌体为抗原，所说的重组T7噬菌体表面表达有氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的Mya98谱系FMDV VP1(129-169)位多肽，所说的多肽由VP1(129-169)基因插入T7噬菌体P10B基因下游融合表达获得。

所述的Mya98谱系FMDV VP1(129-169)位多肽基因选自以下序列的核苷酸：

1)具有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列；