[发明专利]一种从人胚胎干细胞分化成神经细胞的方法

权利要求书

1.一种从人胚胎干细胞诱导分化神经细胞的方法，其特征在于所述方法为：将人胚胎干细胞进行分离纯化，获得人胚胎干细胞单体，将人胚胎干细胞单体按1～5×10⁴个/cm²的细胞密度接种进行单层贴壁诱导培养，所述诱导培养是以丁酸钠结合诱导培养基I对人胚胎干细胞进行预诱导，再以诱导培养基Ⅱ进行分化诱导培养，获得神经细胞；所述诱导培养基I以DMEM为基础培养基，还包含维持或促进细胞生长的营养物质；所述诱导培养基Ⅱ以KO-DMEM为基础培养基，还包含维持或促进细胞生长的营养物质。

2.如权利要求1所述的从人胚胎干细胞诱导分化神经细胞的方法，其特征在于所述人胚胎干细胞按3×10⁴个/cm²的细胞密度进行单层贴壁诱导培养。

3.如权利要求1所述的从人胚胎干细胞诱导分化神经细胞的方法，其特征在于所述诱导培养基I以DMEM为基础培养基，加入终浓度如下的营养物质：15％胎牛血清，2mM L-谷氨酰胺，1mM MTG，1％非必需氨基酸，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素。

4.如权利要求1所述的从人胚胎干细胞诱导分化神经细胞的方法，其特征在于所述诱导培养基Ⅱ以KO-DMEM为基础培养基，加入终浓度如下的营养物质：50％的N2和B27血清替代物，15％KO-血清替代物，2mM L-谷氨酰胺，1mM MTG，1％非必需氨基酸，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素。

5.如权利要求1所述的从人胚胎干细胞诱导分化神经细胞的方法，其特征在于所述丁酸钠在诱导培养基I中的终浓度为1～10mM。

6.如权利要求1所述的从人胚胎干细胞诱导分化神经细胞的方法，其特征在于所述诱导培养是以丁酸钠结合诱导培养基I对人胚胎干细胞于37℃，5％CO₂，100％湿度条件下预诱导培养1～3天，倾去培养液，再加入诱导培养基Ⅱ中继续于37℃，5％CO₂，100％湿度条件下分化诱导培养8～14天，获得所述神经细胞。

7.如权利要求6所述的从人胚胎干细胞诱导分化神经细胞的方法，其特征在于所述预诱导培养2天，分化诱导培养8～12天。

8.如权利要求1所述的从胚胎肝细胞分化成神经细胞的方法，其特征在于：所述方法为：(1)分离纯化：将人胚胎干细胞接种至0.1～2％明胶包被的培养孔板中的小鼠成纤维饲养层细胞上，于人胚胎干细胞培养液中，37℃，5％CO₂，100％湿度条件下培养5～8天，获得扩增人胚胎干细胞和小鼠成纤维细胞混合物；将获得的混合物于消化液中，37℃消化5min，获得悬浮液，并置于含人胚胎干细胞培养液的0.1～2％明胶包被的培养瓶中，37℃贴壁培养1～2h，贴壁结束，将培养液离心，弃去上清液，获得人胚胎干细胞单体；所述的消化液为终浓度0.05％胰蛋白酶和终浓度0.02％乙二胺四乙酸混合溶液；所述人胚胎干细胞培养液以KO-DMEM为基础培养基，加入终浓度如下的物质：10％l胎牛血清，10％KO-血清替代物，2mM L-谷氨酰胺，0.1mM 2-β-巯基乙醇，1％非必需氨基酸，10U/ml人白细胞抑制因子(LIF)，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素和10U/ml碱性成纤维细胞生长因子，pH7.0～7.4；(2)将分离纯化的人胚胎干细胞单体以3×10⁴个/cm²的细胞密度接种于10μg/ml多聚赖氨酸包被的培养孔板上，于含2.5mM丁酸钠的诱导培养基I中37℃，5％CO₂，100％湿度条件下预诱导培养2天，倾去培养液，再加入诱导培养基Ⅱ中继续37℃，5％CO₂，100％湿度条件下分化培养10天，获得所述神经细胞。