[发明专利]一种从人胚胎干细胞分化成神经细胞的方法

说明书

(一)技术领域

本发明涉及发育生物学、细胞生物学和细胞治疗领域，更具体地涉及一种人胚胎干细胞定向分化技术，本发明提供了在体外将人胚胎干细胞诱导为神经细胞的新方法。

(二)背景技术

细胞移植治疗神经系统疾病是当今生物医学研究的一个热门领域，尽管目前细胞治疗已经取得很大进展，但由于细胞来源及供体短缺等因素，限制了其临床应用的步伐，同时也带来伦理道德的争论。胚胎干细胞是能在体外培养的高度未分化细胞，具有多潜能性，可以诱导分化成多种组织细胞。将胚胎干细胞定向诱导分化成特定类型的神经细胞，不但可以解决上述问题，还可以使供体细胞对不同神经系统疾病更具靶向性。

胚胎干细胞体外分化为神经细胞的研究始于1981年，迄今为此，诱导胚胎干细胞分化为神经细胞的方法通常有无血清诱导法、全反式维甲酸诱导法、可溶性因子诱导法、基质细胞共培养法等。人胚胎干细胞定向分化面临的一个关键问题就是分化效率和分化细胞的均匀性。胚胎干细胞在培养和分化过程中，如果细胞以悬浮方式培养时，它们会聚集形成球状细胞团(拟胚体)。拟胚体一般具有外、中、内三胚层结构，且其体外生长分化能够模拟正常胚胎的发育过程。目前，胚胎干细胞定向分化的研究很大部分都是围绕这一基础进行的。然而，这一方法也存在着诸多弊端，首先三胚层结构复杂，细胞种类多且分布不均；其次操作程序繁杂，前期需要制作拟胚体，后期还得筛选目的细胞。本发明的基本策略是使人胚胎干细胞在单细胞的状态下尽快贴壁，避免其形成拟胚体状态，不仅排除各胚层细胞之间复杂的相互作用的干扰，且使得所有的胚胎干细胞处于均一的分化环境。

丁酸钠属于一类短链脂肪酸，它能够抑制组蛋白脱乙酰基酶的活性，2003年Geron公司研究人员发现丁酸钠可通过拟胚体途径诱导人胚胎干细胞定向分化为肝细胞，随后也有文献报道丁酸钠可诱导胚胎干细胞分化为胰腺细胞，这说明丁酸钠抑制组蛋白脱乙酰化作用并不是针对某类细胞谱系特异基因所在的染色质特定区域，它只是随机地松散染色质。本发明先利用丁酸钠打破组蛋白乙酰化的平衡，促使染色质松散，从而抑制胚胎干细胞增殖，使其尽快进入分化状态；结合单层直接贴壁分化方法并添加特定的诱导培养基，即可在相对短的时间里获得高比例的神经细胞。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种在体外将人胚胎干细胞诱导分化成神经细胞的新方法，所述方法是以丁酸钠作为分化诱导剂，联合神经诱导培养液，通过人胚胎干细胞直接单层贴壁、二步诱导途径实现的。

本发明所用细胞材料和试剂说明如下：

A，人胚胎干细胞(hESCs)

本发明所述人胚胎干细胞可以以任何方式获得，都可用于本发明，如各种文献中公开确立的hESCs，保藏机构或者商家购买得到的hESCs，流产胚胎或不同发育阶段的囊胚分离得到的hESCs均可，本发明采用的H1人胚胎干细胞系购自WiCell Research Institute，Madison WI，USA.，NIH编号WA01，参见http://wicell.org/。

B，培养液及试剂：

本发明所用培养液可在常用的细胞基本培养基的基础上补充一种或多种成分而得到。可用于本发明的细胞基本培养基可以包括但不仅限于：DMEM、MEM、RPMI1640、F-10、F12、αMEM、KO-DMEM以及IMDM。这些培养基的配方是本领域所公知的，不仅在普通教科书和实验手册中有详细描述，而且还可以直接以成品的形式从公司购买获得。

作为补充物的成分可以是任何维持或促进细胞生长的成分。他们可以包括但不限于：氨基酸、维生素、蛋白、激素、金属离子、微量元素、脂肪酸、糖等等。

作为举例，本发明可使用包含如下成分组合的培养基，除非另外指出，本发明所用试剂均购自invitrogen公司。

(1)人胚胎干细胞培养液：基本培养基：KO-DMEM

补充物(维持或促进细胞生长的营养物质)：10％KO-血清替代物；10％胎牛血清；2mM L-谷氨酰胺；0.1mMβ-巯基乙醇；1％非必需氨基酸；10U/ml人白细胞抑制因子(LIF)；100U/ml青霉素；100ug/ml链霉素；4ng/ml人重组碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)；pH7.0～7.4。

(2)诱导培养基I：

基本培养基：DMEM

补充物(维持或促进细胞生长的营养物质)：15％胎牛血清；2mM L-谷氨酰胺；1mM硫代甘油(MTG)(sigma)；1％非必需氨基酸；100U/ml青霉素；100ug/ml链霉素；pH7.0～7.4。

(3)诱导培养基II：