[发明专利]松花粉超临界萃取物中总黄酮含量的测定方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种松花粉超临界萃取物中总黄酮含量的测定方法。

背景技术

松花粉(Pollen Pini)是松科植物马尾松(Pinus massonina lamb)、油松(Pinus tabulaefermiscarr)等植物于春季花刚开时将雄球采摘，晒干，搓下花粉，收集，除去杂质所得的淡黄色细花粉[参见：ChP(中国药典).2010.Vol I(一部)：191]。松花粉是天然的微型营养库。作为优良的保健食品，松花粉的营养成分可以分为糖、蛋白质、脂肪、维生素、微量元素和生物活性物质六大类。其所含的多种酶、激素、黄酮以及丰富的磷脂等生物活性物质对人体的生命活动有重要的调节作用，具有抗衰老、抗疲劳、调节血脂、降血糖、护肝、美容、减肥等多种药理作用，是花粉产品中的佼佼者。

松花粉活性成分复杂，虽被《中国药典》收载，规定了制法、显微鉴别和检查项目，但未对其活性有效成分的含量做出质控标准。目前的文献表明：松花粉中的黄酮类化合物多以甙的形式存在，具有多方面的生理活性。可有效清除体内的氧自由基，其阻止氧化的能力是维生素E的十倍以上，可阻止细胞的退化、衰老。所富含的磷脂更是具有显著的降血脂等多种药理活性。近20年来生物医学研究表明：磷脂具有调节生理机能、增强免疫力、防治心、脑、血管等疾病的作用。但磷脂遇热不稳定，给传统的溶剂提取带来困难。

超临界流体萃取(supercritical fluid extraction，SFE)是近代分离领域出现的高新技术，除减少有机溶剂用量外，还有萃取效率和选择性高、适用于热不稳定物质的提取、环境污染小、操作条件易于改变等特点，是一种较为理想的中药活性物质提取方法。对松花粉进行超临界CO₂萃取，可以避免有机溶剂的残留，提高产率，同时在提取过程中不易破坏松花粉中的有效活性物质，大大提高活性成分的萃取量。[参见：邵兴军，丁德华，郦宏岩等.超临界CO₂萃取松花粉中有效成分的方法.[P]中国专利：200810155138.3，2009-03-18；冯武，范国栋，刘嘉宝.云南松花粉超临界CO₂脱脂研究.[J]云南林业科技.2003，(1)：63。]

松花粉超临界萃取物作为具有广阔市场前景的中药提取物，制定其质量评价标准对其在中药产业的发展有非常重要的意义，特别是针对其中多个典型活性成分建立有效的分析方法从而从总体上把握萃取物的质量情况尤为重要。目前，国内外尚未见针对松花粉超临界萃取物进行黄酮类成分的含量测定文献及专利。本发明首次针对超临界流体萃取松花粉中的总黄酮建立了简便可行的分析方法，为制定松花粉超临界萃取物的质量标准提供了一个可靠的依据，同时也为进一步合理开发和综合利用该萃取物提供了质量评价手段。

发明内容

本发明的目的在于设计提供一种针对超临界流体萃取松花粉中总黄酮成分建立含量测定方法的技术方案。对萃取物中的总黄酮运用紫外可见分光光度法进行测定，简便可行，准确度、精密度良好，能通过活性成分的含量测定把握萃取物的质量情况，可作为松花粉超临界萃取物的质量评价依据。

本发明的技术方案如下：

一种松花粉超临界萃取物(SFE-PP)中总黄酮含量的测定方法，它包括如下步骤：

步骤1.标准储备液的制备：精密称取芦丁对照品适量，加甲醇溶解并定容至100ml，配成150μg·ml^-1的芦丁标准储备液；

步骤2.供试样品溶液的制备：

1.精密称取松花粉超临界萃取物2.0000g，用滤纸包紧置于平底烧瓶中，加入100ml 70％乙醇溶液，浸润后在80℃水浴下回流2h，粗提液冷却后减压抽滤，用少量25％乙醇洗涤烧瓶和滤渣，合并滤液，减压蒸馏除去其中的乙醇，倒出烧瓶内溶液，抽滤，并用30ml热水分3次洗涤烧瓶，抽滤后，将滤液倒入分液漏斗中，以75ml三氯甲烷分3次萃取脱脂，收集水溶液，旋转蒸发至干后加70％乙醇溶解后用于下述的柱层析加样；

2.取经预处理的聚酰胺树脂粉末湿法装柱，用水饱和，吸取上述脱脂后的样品沿层析柱慢慢滴入柱内，放置一定时间，至待测液被充分吸附后，用70％乙醇洗脱，收集洗脱液，上述洗脱液浓缩定容得供试样品溶液，用于测定总黄酮的含量；